高紅秀 金正勛 李宗泰 張習(xí)春 韓邦東 張忠臣

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；*通訊作者:zzcneau@neau.edu.cn）

2015年黑龍江省水稻產(chǎn)區(qū)稻瘟病菌生理小種鑒定

高紅秀 金正勛 李宗泰 張習(xí)春 韓邦東 張忠臣*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；*通訊作者:zzcneau@neau.edu.cn）

稻瘟病是寒地水稻種植區(qū)的主要病害之一。為明確黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)稻瘟病菌生理小種的種群結(jié)構(gòu)及變化趨勢，利用7個(gè)中國統(tǒng)一鑒別寄主對2015年在黑龍江省部分稻作區(qū)采集并分離得到的99個(gè)稻瘟病單孢菌株進(jìn)行鑒定，共鑒定出6個(gè)群17個(gè)生理小種。其中，ZA和ZD為黑龍江省水稻產(chǎn)區(qū)的主要優(yōu)勢菌群，出現(xiàn)頻率分別為60.61%、18.18%；ZA49為優(yōu)勢小種，出現(xiàn)頻率為23.23%，其次是ZD1，出現(xiàn)頻率為18.18%，再次是ZA1，出現(xiàn)頻率為16.16%。不同地區(qū)生理小種的類型及其組成不同。

水稻；稻瘟病菌；生理小種；分離與鑒定

稻瘟病是由 Mangnaporthe grisea（hebert）Barr.（Pyricularia oryzae Cav.）引起的一種真菌性病害，其發(fā)生具有群發(fā)性、突發(fā)性和毀滅性等特點(diǎn)，是我國水稻生產(chǎn)危害最為嚴(yán)重的病害之一。一般流行年份可導(dǎo)致10%～20%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失可達(dá)40%～50%，甚至絕收[1]。另外，稻瘟病對稻米品質(zhì)也有一定的影響，特別是穗頸瘟在水稻灌漿期影響水稻灌漿，增加了稻米堊白粒率。

黑龍江省是我國水稻生產(chǎn)大省，稻瘟病是威脅黑龍江省水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要病害之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國歷史上有13次稻瘟病大發(fā)生年，累計(jì)稻谷損失達(dá)60億kg。特別是近幾年，如1999年、2002年、2005年、2006年黑龍江省稻瘟病大發(fā)生，平均每年至少損失近10億元人民幣，嚴(yán)重影響稻農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入[2]。目前，稻瘟病的防治主要是依靠抗病品種的選育，但稻瘟病菌是一個(gè)高度分化變異的群體，使得抗病品種容易喪失抗性而淪為感病品種，造成嚴(yán)重?fù)p失[3]。因此，及時(shí)掌握優(yōu)勢生理小種的分布及其變化動(dòng)態(tài)，是保證栽培的水稻品種具有抗病性的重要工作內(nèi)容[4]。本研究利用7個(gè)中國稻瘟病生理小種鑒別品種，對2015年在黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)分離得到的99個(gè)稻瘟病單孢菌株進(jìn)行生理小種鑒定，初步明確了黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)稻瘟病菌生理小種的種群結(jié)構(gòu)及變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試鑒別品種

采用的鑒別品種共有7個(gè)，分別是：特特普、珍龍13、四豐 43、東農(nóng) 363、關(guān)東 51、合江 18、麗江新團(tuán)黑谷。

表1 稻瘟病病斑國際分級標(biāo)準(zhǔn)

1.1.2 供試菌株

在黑龍江省部分稻作區(qū)采集具有稻瘟病典型癥狀穗頸節(jié)和葉片，分別來源于黑龍江省哈爾濱市、綏化市、齊齊哈爾市、佳木斯市、牡丹江市、密山市等水稻產(chǎn)區(qū)，共分離得到99個(gè)單孢菌株。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 秧苗培育

選取鑒別寄主的種子，用0.6%稀硝酸浸泡不超過20 h，用清水沖洗干凈，加蒸餾水浸泡至出芽。采用塑料盤育秧，播種前使土壤充分吸水，將催芽后的種子播于事先裝好土的塑料營養(yǎng)缽中，每個(gè)品種播15粒左右，播種后用塑料膜覆蓋保濕，放置在人工塑料大棚內(nèi)育秧。待幼苗破土后移去塑料膜，期間密切關(guān)注幼苗的生長狀態(tài)，調(diào)控水肥培育健壯幼苗，嚴(yán)防病害發(fā)生。在接種前3～5 d施用一定量的硫酸銨，便于接種后葉片保持濃綠。

表2 2015年黑龍江省稻瘟病菌生理小種鑒定結(jié)果

1.2.2 菌株的分離

取新采集的發(fā)病組織，用無菌水沖洗，再用75%酒精表面擦洗后，再浸泡10 min，隨后用無菌水沖洗3次。將處理好的病樣放入無菌水中6 h，使其充分吸水。然后在鋪有吸水紙的滅菌培養(yǎng)皿中加入少量無菌水（浸濕吸水紙即可），把沖洗過的病組織放入其中，蓋好后置于26℃～28℃黑暗保濕架空培養(yǎng)直至產(chǎn)生灰綠色霉層。用鑷子夾起出現(xiàn)霉層的病樣置于清水瓊脂平板上方，然后對著平板方向敲擊病組織，使孢子落到培養(yǎng)基中，26℃～28℃暗培養(yǎng)至出現(xiàn)白色針狀菌落。尋找周圍無其他菌落相連的單個(gè)菌落，用解剖刀輕輕地挑取一小塊培養(yǎng)基，移入燕麥番茄瓊脂培養(yǎng)基中，置于26℃～28℃暗培養(yǎng)即可獲得單孢菌株。

1.2.3 病菌的擴(kuò)繁和產(chǎn)孢

將稻瘟病菌接種在燕麥片番茄汁瓊脂培養(yǎng)基上，于25℃～27℃條件下培養(yǎng)5～7 d。用無菌水輕輕洗下菌絲（菌絲團(tuán)要小，太大不利于涂布均勻）和分生孢子，將其懸浮液均勻涂于另一新的35～40 cm厚的平板培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基要適當(dāng)硬一些），每皿約400～500 μL懸浮液，超凈工作臺中吹干。然后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約35～40 h至培養(yǎng)基表面長出一層稀疏的氣生菌絲體。涂布向菌落上加少量自來水，用棉簽輕輕擦去表面的氣生菌絲，并用水將培養(yǎng)基表面的菌絲和分生孢子清洗干凈，待培養(yǎng)基表面晾干后罩上2層紗布，用皮筋綁好，于25℃黑光燈照條件下培養(yǎng)至有大量分生孢子產(chǎn)生。從培養(yǎng)基上洗下分生孢子，用0.05%（體積比）Tween 20水溶液懸浮，孢子懸浮液濃度調(diào)至2×105個(gè)孢子/mL，供接種使用。

1.2.4 接種

待稻苗長至3葉1心時(shí)，將配制好的孢子懸浮液用小噴霧器進(jìn)行隔離噴霧接種至各鑒別品種上，使霧滴均勻分布在葉片表面及莖稈上，接菌后將其移至保濕棚內(nèi)進(jìn)行保溫保濕管理，以促使其發(fā)病。

1.2.5 病情調(diào)查與分級

接種后7～10 d，待其充分發(fā)病后調(diào)查病情及生理小種命名[5]。病斑分級標(biāo)準(zhǔn)見表1，R為抗病反應(yīng)，S為感病反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌生理小種的組成及出現(xiàn)頻率

從表2可見，2015年用7個(gè)中國稻瘟病菌鑒別寄主將分離純化得到的99個(gè)單孢菌株進(jìn)行生理小種檢測，共鑒定出6群17個(gè)生理小種。即ZA群里有ZA1、ZA9、ZA13、ZA17、ZA25、ZA33、ZA49、ZA57共 8 個(gè)生理小種；ZB 群里有 ZB1、ZB9、ZB17、ZB29共 4 個(gè)生理小種；ZC 群里有ZC1、ZC72個(gè)生理小種；ZD群里只有ZD11個(gè)生理小種；ZE群里只有ZE11個(gè)生理小種；ZF群里只有ZF11個(gè)生理小種。

從表2可見，在6個(gè)種群中，出現(xiàn)頻率最高的是ZA群，為優(yōu)勢菌群，出現(xiàn)頻率為60.61%；其次是ZD群、ZE群、ZB群、ZC群和ZF群，出現(xiàn)頻率依次為18.18%、9.09%、8.08%、3.03%和1.01%。

表3 2015年黑龍江省稻瘟病菌生理小種分布

從表2可見，在17個(gè)生理小種中，出現(xiàn)頻率最高的是ZA49，為優(yōu)勢小種，出現(xiàn)頻率為23.23%；ZD1出現(xiàn)頻率為 18.18%，ZA1為 16.16%，ZA17為 10.10%，ZE1為9.09% ，ZA33、ZB1均 為 4.04% ，ZA13、ZA25、ZA57、ZB9、ZC7均為 2.02%，ZA9、ZB17、ZB29、ZC1、ZF1均為 1.01%。

2.2 稻瘟病菌生理小種的分布及分析

由表3可知，各個(gè)地區(qū)稻瘟病菌生理小種組成因地區(qū)而異，但在某些地區(qū)也存在著共同的生理小種。其中，ZA49廣泛分布在哈爾濱市阿城區(qū)、通河縣、方正縣、泰來縣、牡丹江市、穆棱市、佳木斯市、密山市和綏化市；ZD1分布在哈爾濱市、哈爾濱市阿城區(qū)、通河縣、泰來縣、牡丹江市、穆棱市、佳木斯市、密山市、綏化市、慶安縣和肇源農(nóng)場；ZA1分布在哈爾濱市阿城區(qū)、通河縣、延壽縣、泰來縣、牡丹江市、佳木斯市、蘿北縣、綏化市、慶安縣和肇源農(nóng)場；ZA17分布在通河縣、方正縣、穆棱市、密山市、綏化市和肇源農(nóng)場。而有些生理小種分布地區(qū)卻有限，如ZA9只分布在肇源農(nóng)場，ZB17只分布在綏化市，ZF1只分布在通河縣。

3 結(jié)論與討論

本研究利用 7個(gè)中國稻瘟病生理小種鑒別品種，對黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)2015年采集到的99個(gè)單孢菌株進(jìn)行生理小種鑒定，共鑒定出6個(gè)群17個(gè)生理小種。其中，ZA和ZD為黑龍江省水稻產(chǎn)區(qū)的主要優(yōu)勢菌群，ZA49、ZD1、ZA1為優(yōu)勢小種?？梢?，2015 年在黑龍江省ZA和ZD菌群是導(dǎo)致取樣稻作區(qū)水稻稻瘟病高發(fā)的主要原因。2002年，張亞玲等[6]對57個(gè)單孢菌株進(jìn)行鑒定，分出6群10個(gè)生理小種，其中ZD1為優(yōu)勢小種；2001-2006年，宋成艷等[7]分離純化得到189個(gè)單孢菌株，鑒定出7群28個(gè)生理小種，其中ZA、ZD、ZB為優(yōu)勢菌群，ZA49和ZD1是優(yōu)勢小種；2006年，肖佳雷等[8]對黑龍江省134個(gè)單孢菌株進(jìn)行鑒定，分出 6群14 個(gè)生理小種，ZE1、ZG1、ZF1、ZE3為優(yōu)勢小種；2005-2007年，張俊華等[9]分離獲得268個(gè)單孢菌株，共鑒定出7群31個(gè)生理小種，其中，ZA、ZD、ZB為黑龍江省稻區(qū)的主要優(yōu)勢小種群，ZD1是優(yōu)勢小種；2008-2009年，孫洪利等[10]分離到356個(gè)單孢菌株，共鑒定出7群34個(gè)小種，其中，ZA、ZC和ZB為黑龍江省稻區(qū)的主要優(yōu)勢小種群，ZB1為優(yōu)勢小種；郭麗穎等[11]對 2012年采集的130個(gè)稻瘟病菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果共鑒定出7個(gè)群38個(gè)生理小種，其中，ZA群和ZD群為優(yōu)勢群體，所占比例為43.85%和33.85%?？梢?，2015年黑龍江省水稻產(chǎn)區(qū)ZA群比例有所增加，ZD群比例有所降低表明ZA已成為黑龍江省水稻產(chǎn)區(qū)的主要優(yōu)勢菌群，是導(dǎo)致稻瘟病大面積發(fā)生的重要原因，在今后的育種工作中應(yīng)拓寬抗ZA菌群的水稻種質(zhì)資源，加速選育抗ZA菌群的新品種。

本研究鑒定劃分出的6群17個(gè)生理小種，優(yōu)勢小種為 ZA49、ZD1、ZA1，廣泛分布于哈爾濱市、通河縣、泰來縣、牡丹江市、佳木斯市和綏化市。但有些生理小種如ZA9只分布在肇源農(nóng)場，ZB17只分布在綏化市，ZF1只分布在通河縣。從稻瘟病菌生理小種分布來看，不同地區(qū)的生理小種組成各不相同。影響生理小種組成的因素有很多，栽培品種、氣象條件、環(huán)境因素、管理措施等條件的不同都會導(dǎo)致各地區(qū)生理小種的組成有所不同。因此，不同地區(qū)選擇種植的抗病品種和防治措施也應(yīng)因地制宜，這樣才能適應(yīng)生產(chǎn)的需要，降低稻瘟病的發(fā)病率，提高水稻產(chǎn)量。

防治稻瘟病的措施主要有選育抗病品種、消滅越冬菌源、合理的耕作栽培技術(shù)措施、做好預(yù)測預(yù)報(bào)工作、提高種植戶的預(yù)防意識等，其中最經(jīng)濟(jì)有效的措施是選育和利用抗病品種[12-14]。但是，由于稻瘟病菌生理小種的高度變異性與黑龍江省穗頸瘟抗性資源的狹窄性，導(dǎo)致新選育的品種很快就喪失了抗瘟性，并且長期種植單一品種或水稻栽培品種的更替都會導(dǎo)致新的優(yōu)勢小種的出現(xiàn)。水稻稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)逐年發(fā)生變化，可導(dǎo)致主栽品種由抗病品種變成感病品種，從而使黑龍江省稻瘟病大發(fā)生。因此，系統(tǒng)監(jiān)測稻瘟病菌的種群動(dòng)態(tài)，合理布局抗病品種，優(yōu)化不同抗性品種的搭配，對稻瘟病防控政策的制定有一定的指導(dǎo)意義。

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Abstract:Rice blast is one of the important disease in cold region.To identify the population structure and trends of rice physiological races in part areas of Heilongjiang Province,7 differential hosts of China were used to analyze the physiological races collected from the counties of Heilongjiang Province in 2015.The results showed that 99 blast isolates were obtained and categorized into 6 groups with 17 races,and that ZA and ZD were the dominant groups,with the average frequency of 60.61%and 18.18%,respectively.The race ZA49was the dominant race with the average frequency of 23.23%;secondly,the average frequency of the race ZD1was 18.18%;moreover,the average frequency of the race ZA1was 16.16%.The types and compositions of the physiological races were varied in different rice areas.

Key words:rice;Pyricularia oryzae;physiological race;isolation and identification

Identification of the Physiological Races of Rice Blast Fungus in Part Areas of Heilongjing Province in 2015

GAO Hongxiu,JIN Zhengxun,LI Zongtai,ZHANG Xichun,HAN Bangdong,ZHANG Zhongchen*
（College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;*Corresponding author:zzcneau@neau.edu.cn）

S435.111.4+1

A

1006-8082（2017）05-0050-04

2017-05-14

科技部“十三五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BA D23B05-11）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0300604-4）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目；黑龍江省糧食產(chǎn)能提升協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目