郭蓮娣,王 丹，唐子執(zhí)，曾 鳴，王小軍，劉 聰，李友偉

(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，成都 610041；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，成都 610041；3.四川省德陽市人民醫(yī)院肝膽外科 618000)

乙型肝炎病毒抑制肝細胞免疫檢查點PD-1配體基因表達的研究*

郭蓮娣1,王 丹1，唐子執(zhí)2，曾 鳴2，王小軍2，劉 聰2，李友偉3△

(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，成都 610041；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，成都 610041；3.四川省德陽市人民醫(yī)院肝膽外科 618000)

目的在細胞水平上分析乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制及其編碼的X基因(HBx)表達對細胞基因表達譜的影響，特別是免疫相關(guān)基因表達水平的變化。方法通過慢病毒和pcDNA瞬時轉(zhuǎn)染過表達HBx基因，利用RNA-Seq和RT-qPCR等方法檢測免疫相關(guān)基因的表達水平，并在HBV復(fù)制細胞系中進行驗證。結(jié)果HBV復(fù)制和HBx表達可以劑量依賴性抑制免疫檢查點程序性死亡分子1(PD-1)配體基因(PD-L1/CD274)的表達，而HBx基因的H-box突變體的表達失去該抑制效應(yīng)。結(jié)論HBV/HBx具有抑制PD-L1/CD274基因表達的能力，在病毒感染的急性期解除抗原特異性T細胞激活的檢查點，活化細胞毒性T細胞，這可能導(dǎo)致T細胞對高度復(fù)制的細胞進行攻擊和清除，幫助病毒進入較低復(fù)制狀態(tài)，達到病毒-宿主的平衡狀態(tài)并奠定HBV慢性感染的基礎(chǔ)。

肝炎病毒，乙型；HBx；免疫檢查點；PD-L1/CD274

目前，免疫治療通過刺激機體免疫系統(tǒng)提高內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)，已成為治療腫瘤的新方向。其中免疫檢查點程序性死亡分子1(programmed death 1,PD-1)和PD-1配體(PD-1 ligand,PD-L1/CD274)信號通路的激活有助于腫瘤免疫逃逸,對腫瘤的治療有非常重要的臨床意義[1-4]。在乙型肝炎病毒(HBV)感染過程中， PD-L1/CD274的基因表達及其在HBV免疫中的作用機制，HBV是否利用免疫檢查點干擾宿主免疫系統(tǒng)，還未被深入研究。HBV的HBx蛋白是具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)，廣泛參與病毒的復(fù)制、蛋白質(zhì)降解等過程，在HBV感染及原發(fā)性肝細胞癌誘發(fā)中起關(guān)鍵作用[5-6]。本研究通過探討HBV HBx的基因表達對免疫檢查點信號PD-L1/CD274基因的調(diào)節(jié)，為進一步探討免疫檢查點PD-L1/CD274在HBV感染與宿主細胞、肝臟微環(huán)境和免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的相互作用機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 細胞系293T、L02和T43，大腸桿菌菌種DH5α，載體質(zhì)粒cDNA及慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒均由華西第二醫(yī)院基因組穩(wěn)定性實驗室提供； 胎牛血清購自Invitrogen；Infusion克隆試劑盒、T4 DNA連接酶購自Clontech；限制性內(nèi)切酶、聚偏氟烯(PVDF)膜及轉(zhuǎn)染試劑購自Fugene； ECL發(fā)光底物購自Millipore；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和總RNA提取試劑盒購自Qiagen；引物合成及測序由上海生工生物工程有限公司完成；RNA反轉(zhuǎn)錄使用Promega-A3500 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用Promega Go Taq?qPCR Master Mix試劑盒完成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 293T、L02和T43細胞為貼壁生長細胞，將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。待細胞貼壁生長至90%匯合度時，棄上清液后加入0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸細胞消化液進行細胞傳代。

1.2.2分子克隆 通過NCBI查找HBx的DNA序列，基因號為：DQ629997.1，合成其DNA片段并作為模板，設(shè)計帶有酶切位點的上、下游引物：5′-GTA CGA ATT CAT GGC TGC TCG GAT GTG CTG-3′;5′-GAT CGG ATC CTT ACG CAG AGG TGA AAA AGT TG-3′，PCR擴增出對應(yīng)的DNA片段后純化回收，對DNA片段和載體pLVX-IRES-ZsGreen1或pcDNA3.1進行雙酶切(EcoRⅠ；BamHⅠ)，通過T4 DNA連接酶連接DNA片段和載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的平板上篩選陽性克隆并鑒定測序，得到重組的pLV-HBx或pcDNA3-HBx載體。

1.2.3慢病毒包裝 將對數(shù)生長期的293T細胞用胰蛋白酶消化，以2.5×106密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，直至細胞匯合度達60%～70%時開始轉(zhuǎn)染。將慢病毒包裝系統(tǒng)中的3種質(zhì)粒DNA溶液(pLV-HBx 10 μg、psPAX2 7.5 μg、pMD2.G 6 μg)用適量無血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋，隨后加入60 μL Roche X-treme GENE HP輕柔混勻，室溫孵育 20 min以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將上述復(fù)合物加到細胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，培養(yǎng)6～10 h后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達到90%以上；分別于48 h和72 h收集病毒上清液，再以直徑為 0.45 μm的濾器過濾后，分裝貯存待用。

1.2.4基因表達譜(RNA-Seq)測定與分析 感染pLV-HBx或pLV-EGFP病毒的L02細胞經(jīng)總RNA提取、mRNA富集和建立cDNA文庫等步驟，進行Illumina-HiSeq測序。獲得原始測序序列后，利用HTSeq、DEGSeq和KOBAS等軟件進行參考序列比對、基因表達水平、基因差異表達、轉(zhuǎn)錄因子和GO/KEGG等生物信息學(xué)分析。

1.2.5mRNA提取 將所孵育的3.5 cm2細胞板中加入1 mL Trizol，冰上放置5 min后用槍頭吹打，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入0.2 mL氯仿振蕩15 s，靜置并離心； 小心吸取離心后上層無色液體(RNA層)移入Qiagen RNA提取試劑盒的吸附柱，經(jīng)過吸附和洗脫等過程，用50 μL的 DEPC水溶解并離心得到RNA。-70 ℃冰箱保存。 紫外分光光度計測定細胞RNA在260 nm和280 nm處的吸光度值(A),計算RNA的含量和純度。

1.2.6半定量及熒光定量RT-PCR 2 μg RNA與反轉(zhuǎn)錄引物oligdT混勻，70 ℃加熱5 min后立即冰浴5～10 min。根據(jù)Qiagen試劑盒說明書，在反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶抑制劑各1 μL，dNTP (10 mmol/L)1.5 μL，MgCl21.5 μL，5×緩沖液5 μL，DEPC水補足總體積至25 μL，進行體外反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA產(chǎn)物。熒光定量PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，擴增引物(10 mmol/L)各1 μL，2×緩沖液10 μL，DEPC水補足體積至20 μL。每個樣本平行重復(fù)3個定量PCR反應(yīng)。cDNA的半定量檢測使用TIANGEN 2×Taq PCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。所有半定量及定量PCR均選用β-actin基因片段為內(nèi)參。反應(yīng)中涉及引物β-actin：正向引物5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，反向引物5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′；HBx：正向引物5′-ATG GCT GCT CGG TTG TGC TG-3′，反向引物5′-TTA GGC AGA GGT GAA AAA GT-3′；PD-L1：正向引物5′-CTG TCT TTA TAT TCA TGA C-3′，反向引物5′- AAA GCT TCT CCT CTC TCT TG-3′。

1.2.7蛋白免疫印跡(Western blot) 細胞被PBS清洗2次后,加入RIPA細胞裂解液在冰上裂解30 min后,4 ℃ 14 000 r/min離心15 min,收集上清液并采用BCA法測定蛋白濃度,然后將適量細胞總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行分離,并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,電轉(zhuǎn)后的膜在含5% BSA的封閉液中室溫封閉1 h。使用PD-L1/CD274一抗4 ℃孵育過夜,PBST清洗3次,然后使用HRP標記的二抗稀釋液室溫孵育1.5 h,PBST洗3次。最后采用ECL發(fā)光試劑盒檢測,經(jīng)凝膠分析系統(tǒng)曝光,分析并存儲圖片。

2 結(jié) 果

2.1HBx基因干擾L02細胞中免疫相關(guān)基因的表達 HBx克隆于pLV慢病毒載體，經(jīng)293T細胞包裝的慢病毒感染正常肝細胞系(L02)，48 h后收集細胞并提取mRNA，對全基因組表達譜進行定量檢測，并與表達EGFP的空病毒感染組進行，分析比對基因表達的變化。HBx表達總共造成L02基因表達譜中779個基因表達的改變，其中包括上調(diào)基因431個，下調(diào)348個(圖1A、1B)。筆者發(fā)現(xiàn)有22個免疫相關(guān)基因的表達水平受HBx表達的影響而呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)(圖1C)。

A：RNAseq檢測出HBx誘導(dǎo)L02細胞基因表達譜變化的差異基因熱圖。紅色表示高表達基因，藍色表示低表達基因。B：HBx導(dǎo)致的差異基因火山圖。C：HBx導(dǎo)致的22個免疫相關(guān)基因表達的改變柱狀圖，包括PD-L1/CD274、HLA家族和TNF信號通路等

圖1 HBx在肝細胞系中表達造成基因表達譜的改變

2.2HBx基因誘導(dǎo)PD-1/CD274的基因表達 由于免疫檢查點基因PD-1及其配體在細胞毒免疫中的重要性，本研究選擇基因表達受HBx影響的PD-L1/CD274基因進一步研究。HBx基因被克隆到pcDNA3-HA載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后在L02細胞中表達(圖2A)。提取細胞mRNA后進行RT-qPCR定量檢測PD-L1/CD274的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)PD-L1/CD274基因的表達量相對于pcDNA空載體的細胞顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B)；當pcDNA-HBx轉(zhuǎn)染劑量增加，PD-L1/CD274表達則進一步受到抑制，表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)(圖2C)。Western blot實驗也說明HBx基因表達會讓PD-L1/CD274基因的表達受到抑制(圖2D)。當L02細胞過表達H-box突變的HBx基因(R96E)時，PD-L1/CD274的基因表達則不受HBx的影響，說明HBx對該基因表達的干擾依賴于H-box氨基酸基序的功能(圖2E)。

2.3PD-L1/CD274的基因表達在HBV復(fù)制細胞中被抑制 由于慢病毒和pcDNA3表達的HBx水平遠遠高于HBV感染或HBV陽性肝癌的HBx水平，本研究進一步采用整合了HBV基因組，并有HBV病毒活躍復(fù)制，同時HBx基因表達量又相對較低的T43細胞為研究體系[7]。T43細胞及其未整合HBV基因組的源細胞系L02的mRNA抽提后進行RT-qPCR定量。筆者發(fā)現(xiàn)，T43細胞中的PD-L1/CD274基因表達水平顯著低于L02細胞(圖3A)，說明HBV復(fù)制過程中表達的低水平HBx也能夠抑制PD-L1/CD274基因的表達，造成免疫耐受環(huán)境的抑制。該結(jié)果也在HepG2.2.15細胞中得以重復(fù)(圖3B)。當筆者用3TC降低T43細胞的HBV復(fù)制，卻不影響HBx表達的情況下，發(fā)現(xiàn)PD-L1/CD274基因表達不受影響，說明該基因表達的抑制依賴于HBx的水平，卻不依賴HBV的病毒復(fù)制水平(圖3C)。

A：RT-PCR檢測L02細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-HBx質(zhì)粒后，HBx的表達情況;以β-actin的PCR產(chǎn)物為PCR反應(yīng)內(nèi)參。B：L02細胞中表達pcDNA3-HBx后，熒光定量RT-PCR檢測PD-L1/CD274的表達情況;Vector表示空載體。C：L02細胞轉(zhuǎn)染不同劑量的pcDNA3-HBx后檢測PD-L1/CD274的表達水平。D：L02細胞表達HBx后用Western blot檢測PD-L1/CD274的蛋白水平。E：熒光定量RT-PCR檢測野生型和帶有R96E突變的HBx對PD-L1/CD274基因表達的影響

圖2 HBx抑制PD-L1/C D274的基因表達

3 討 論

HBV編碼的X基因具有表觀遺傳調(diào)控的能力，對病毒復(fù)制和基因表達(包括HBx自身的表達)提供正反饋信號，且在病毒感染的轉(zhuǎn)歸和肝硬化、肝癌發(fā)生的過程中均發(fā)揮重要作用[8]。HBx調(diào)控病毒/宿主細胞基因表達的能力取決于其羧基端的H-box氨基酸基序，該基序可以通過劫持泛素化酶CRL4，破壞染色質(zhì)黏連蛋白SMC5/6調(diào)控染色質(zhì)構(gòu)象和基因表達。在H-box功能喪失的情況下，HBx也會喪失調(diào)控病毒基因表達和干擾宿主表觀遺傳的能力[9-10]。

本研究通過RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBV感染導(dǎo)致一系列宿主細胞基因表達的改變，其中包括免疫調(diào)節(jié)基因的增高或降低。其中，本課題組重點研究了在HBx表達和HBV復(fù)制的細胞中， PD-L1/CD274基因的抑制機制。這些實驗表明，HBx是通過H-box基序和CRL4泛素化酶實現(xiàn)對PD-L1/CD274基因表達的抑制。進一步研究有助于解析HBx-CRL4的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如何抑制PD-L1/CD274的基因表達和解除肝細胞的免疫抑制微環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)HBx對PD-L1/CD274基因表達的抑制表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，由于HBV高度復(fù)制的細胞需要更多的HBx協(xié)調(diào)，該結(jié)果提示有病毒活躍復(fù)制的細胞較容易失去PD-L1/CD274的表達，亦容易遭受細胞毒性T細胞的攻擊。同時，在HBV編碼的DNA多聚酶受到藥物抑制，HBx水平不受影響的情況下，HBV對PD-L1/CD274基因表達的抑制則不受影響。

肝臟的對外來抗原具有特殊的耐受機制，可以保護自身免于免疫系統(tǒng)的攻擊，同時也不利于肝內(nèi)病毒的清除，導(dǎo)致病毒長期感染。造成肝臟免疫耐受的機制之一是B7家族的協(xié)同刺激分子在肝臟的表達，特別是PD-L1/CD274。不同于B7家族的其他成員，PD-L1/CD274的表達不僅限于抗原遞呈和淋巴細胞表面，在包括肝臟在內(nèi)的多種外周及腫瘤組織中也有表達[11]。此外，肝細胞表面不僅可以組成性地表達PD-L1/CD274蛋白，且受干擾素(INF-γ)的誘導(dǎo)[12]；因此，肝臟的免疫耐受微環(huán)境有助于保護并容納HBV的長期慢性感染。本實驗結(jié)果則證明，病毒感染本身可以依賴HBx基因，對PD-L1/CD274的基因表達進行抑制，減低肝細胞表面呈現(xiàn)的免疫檢查點信號，有利于CD8+細胞對病毒的識別，并在早期實現(xiàn)對病毒的清除。

然而， HBV抑制PD-L1/CD274基因表達減低的程度依賴于HBx的劑量，即HBx表達量越高，PD-L1/CD274表達受到抑制的程度越高。由于HBx本身的表達量與病毒復(fù)制密切相關(guān)，因此，這種劑量依賴效應(yīng)提示HBV復(fù)制過度劇烈的肝細胞將較大程度地出現(xiàn)PD-L1/CD274表達降低，從而首先受到CD8+細胞的攻擊；而病毒復(fù)制較為溫和的細胞則繼續(xù)依靠免疫耐受機制逃避CD8+細胞的攻擊。從HBV急性感染到慢性化的發(fā)病過程來看，這種病毒復(fù)制/免疫耐受的負反饋機制可以幫助病毒實現(xiàn)與宿主免疫系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，有利于病毒進入慢性感染狀態(tài)。此外，急性期或爆發(fā)性肝炎造成的大面積肝損傷亦可能與大量病毒復(fù)制解除免疫抑制/耐受的檢查點有關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)HBV通過HBx的表觀遺傳調(diào)控功能抑制宿主細胞免疫檢查點PD-L1/CD274的基因表達，可以部分和局部解除肝臟的免疫抑制微環(huán)境，有助于清除病毒復(fù)制過剩的肝細胞，以達到病毒復(fù)制和宿主免疫之間的平衡，幫助病毒進入慢性感染階段。

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HepatitisBvirusinhibitsexpressionoflivercellimmunecheckpointPD-1ligandgene*

GuoLiandi1,WangDan1，TangZizhi2，ZengMing2，WangXiaojun2，LiuCong2，LiYouwei3△

(1.CollegeofPharmacy,SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan610041，China；2.WestChinaSecondHospital，SichuanUniversity，Chengdu，Sichuan610041，China；3.DepartmentofHepatobiliarySurgery，DeyangMunicipalPeople′sHospital,Deyang,Sichuan638000,China)

ObjectiveTo analyze the impact of hepatitis B virus (HBV) replication and its coded X gene (HBx) expression on cell gene expression profile,especially the immune related gene expression level changes.MethodsOverexpressed HBx gene was transiently transfected through lenti-virus and pcDNA3，the RNA-Seq and RT-qPCR methods were used to detect the expression levels of immune related genes,which were verified in HBV replication cell line.ResultsThis study found that the HBV replication and HBx expression suppressed the expression of immune checkpoint PD-1 ligand gene (PD-L1/CD274) in a dose-dependent manner,while the expression of H-box mutant in HBx gene lost this inhibition effect.ConclusionHBV/HBx possesses the ability for inhibiting PD-L1/CD274 ligand gene expression,may relieve the checkpoint of antigen-specific T cell activation in viral infection acute stage,activates cytotoxic T cells,which may cause that T cell attack and clear highly replicated cells,helps virus to enter the lower replication status,and reaches the balance status between virus-host and lays a basis of HBV chronic infection.

hepatitis B virus;HBx;immune checkpoint;PD-L1/CD274

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.003

R512.62

A

1671-8348(2017)27-3752-03

2016-11-21

2017-04-09)

四川省科技廳科技支撐項目(2017FZ0034)；四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會基金資助項目(16PJ144)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610656073)。

郭蓮娣(1974-)，博士，講師，主要從事中藥抗DNA損傷作用的研究。△

，E-mail:1031572133@qq.com。