趙紅偉，和麗麗，韓 華，岳月紅，康 薇，朱葉珊，劉建平

(1.河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050051;2.河北省人民醫(yī)院老年病科，石家莊 050051；3.河北省人民醫(yī)院婦科，石家莊 050051；4.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050051；5.河北省新樂市醫(yī)院消化內(nèi)科 050700；6.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科 063000；7.河北省中醫(yī)院脾胃科，石家莊 050071)

銀杏葉提取物對(duì)腸炎小鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用研究*

趙紅偉1，和麗麗2，韓 華3，岳月紅4，康 薇5，朱葉珊6，劉建平7△

(1.河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050051;2.河北省人民醫(yī)院老年病科，石家莊 050051；3.河北省人民醫(yī)院婦科，石家莊 050051；4.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050051；5.河北省新樂市醫(yī)院消化內(nèi)科 050700；6.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科 063000；7.河北省中醫(yī)院脾胃科，石家莊 050071)

目的探索銀杏葉提取物(EGB 761)對(duì)腸炎模型小鼠結(jié)腸黏膜屏障的保護(hù)作用。方法將30只小鼠分為正常對(duì)照組、模型組、EGB 761組，建立動(dòng)物模型；每天觀察小鼠的一般情況、體質(zhì)量變化、糞便隱血及結(jié)腸組織病理學(xué)的表現(xiàn)，免疫組織化學(xué)熒光染色測(cè)定結(jié)腸組織中occludin-1等緊密連接蛋白的變化。結(jié)果模型組小鼠體質(zhì)量下降，飲水和進(jìn)食明顯減少，EGB 761干預(yù)治療后小鼠的體質(zhì)量回升明顯；EGB 761組可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少，炎癥程度較模型組明顯減輕。模型組結(jié)腸黏膜組織緊密連接蛋白-1(claudin-1)、occludin和zo-1熒光分布較正常對(duì)照組分散，熒光強(qiáng)度減弱，邊緣粗糙；經(jīng)EGB 761干預(yù)后EGB 761組熒光仍沿細(xì)胞膜分布，強(qiáng)度較正常對(duì)照組稍減弱，但仍強(qiáng)于模型組。結(jié)論EGB 761能有改善腸炎模型小鼠結(jié)腸組織炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與加強(qiáng)其腸黏膜屏障的保護(hù)作用有關(guān)。

銀杏葉提取物；潰瘍性結(jié)腸炎；急性期動(dòng)物模型；腸黏膜屏障

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前對(duì)于UC的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但更多的研究更傾向于有害物質(zhì)或病毒穿過腸道的黏膜屏障，與機(jī)體本身的免疫系統(tǒng)反復(fù)接觸及刺激，使機(jī)體免疫發(fā)生異常變化，從而產(chǎn)生大量的免疫炎性因子，使腸道發(fā)生炎性反應(yīng)[1-3]。銀杏葉提取物(ginko biloba extract，GBE 761)的活性成分包括銀杏內(nèi)酯、白果內(nèi)酯，這些銀杏黃酮-糖甙成分具有強(qiáng)大的清除自由基、抗氧化能力，但其是否對(duì)腸黏膜屏障有調(diào)節(jié)作用仍需進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑 30只C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量20～22 g；9～12周齡； EGB 761(金鈉多注射液,德國(guó)威瑪舒培藥廠)；右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS,美國(guó)Sigma)；兔抗zo-1抗體(Invitrogen)、 鼠抗occludin抗體(美國(guó)Santa Cruz)、HRP 抗鼠IgG 、HRP 抗兔IgG (北京中杉有限公司)；將10 g DSS (相對(duì)分子質(zhì)量36 000～50 000)溶于500 mL蒸餾水中后配成了2%濃度的液體，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2造模方法 30只C57BL/6雄性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(10只)、EGB 761組(10只)；模型組、EGB 761組、自由飲用2% DSS 7 d；正常對(duì)照組、自由飲用蒸餾水7 d,EGB 761組每天予EGB 761 1 mL(200 mg/kg)灌腸，正常對(duì)照組和模型組給予PBS灌腸，時(shí)間均為1周，第8天處死所有動(dòng)物。

1.3動(dòng)物的一般情況及疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI) 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，需要每天觀察動(dòng)物的飲食、飲水、精神狀態(tài)、體質(zhì)量、毛發(fā)光澤度、活動(dòng)情況、大便性狀等。按照DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估各組小鼠DAI的變化，DAI=(體質(zhì)量指數(shù)+大便形狀+出血情況)/3。

1.4結(jié)腸組織大體評(píng)分及結(jié)腸病理組織染色(HE染色) 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取部分結(jié)腸組織，固定、包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察腸組織的病理學(xué)改變。

1.5結(jié)腸組織免疫組織熒光染色 將新鮮結(jié)腸組織切片、固定、封閉，室溫放置1 h，加小鼠抗緊密連接蛋白-1(claudin-1)和occludin單克隆抗體，兔抗zo-1多克隆抗體，4 ℃過夜，洗滌液沖洗，滴加標(biāo)記綠色熒光的抗兔FITC或標(biāo)記紅色熒光的抗小鼠Cy3，室溫放置1 h顯示紅色熒光或綠色熒光為陽性表達(dá)。用PBS替代一抗作陰性對(duì)照，其余步驟同上。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DAI變化情況 模型組小鼠體質(zhì)量、飲食、大便情況的變化：實(shí)驗(yàn)第1天，飲用了2%DSS后，觀察小鼠的進(jìn)食及飲水均較多，體質(zhì)量增加；實(shí)驗(yàn)第3天，飲用了2%DSS的模型組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量有所下降，大便偏松散且量有所增加，但無黏液及膿血，動(dòng)物的進(jìn)食和飲水均明顯減少；實(shí)驗(yàn)第5天，模型組出現(xiàn)小鼠的體毛較凌亂，毛發(fā)無光澤，精神萎靡，進(jìn)食及飲水較之前明顯減少，體質(zhì)量較之前有所下降，同時(shí)可見大便偏稀，帶有黏液及膿血；實(shí)驗(yàn)第8天，模型組小鼠精神差，毛較凌亂，進(jìn)食及飲水減少，體質(zhì)量下降，同時(shí)肛周可見肉眼血便。正常對(duì)照組小鼠的飲食、體質(zhì)量、大便情況的變化：正常對(duì)照組從第1～8天小鼠毛發(fā)、精神、活動(dòng)、大便，體質(zhì)量持續(xù)增加。EGB 761組小鼠的飲食、體質(zhì)量、大便情況的變化：應(yīng)用EGB 761 1 mL(200 mg/kg)灌腸干預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠治療的第2天，小鼠的精神尚可，進(jìn)食及飲水正常，體質(zhì)量未下降，可見排稀便；EGB 761干預(yù)UC小鼠的第5天，小鼠精神狀態(tài)好，毛發(fā)有光澤，飲食及飲水量增加，小鼠的體質(zhì)量較模型組也有明顯增加，大便較稀且量較多；EGB 761干預(yù)UC小鼠第7天，EGB 761組小鼠進(jìn)食及飲水較模型組明顯增多，同時(shí)體質(zhì)量也明顯上升，動(dòng)物的精神狀態(tài)良好，毛發(fā)有光澤，大便量多，無黏液及膿血。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，綜合計(jì)算各組動(dòng)物的大便潛血、大便性狀、體質(zhì)量等情況進(jìn)行DAI評(píng)分：在實(shí)驗(yàn)第5天，與正常對(duì)照組動(dòng)物DAI評(píng)分(0.00±0.00)比較，模型組動(dòng)物DAI評(píng)分明顯升高(1.30±0.65，P<0.01)，至實(shí)驗(yàn)第8天模型組DAI評(píng)分升高最為明顯(3.00±0.41，P<0.01)，見圖1。

2.2各組動(dòng)物結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，蠟塊切片行HE染色，可見模型組小鼠結(jié)腸組織上皮破損或缺損，黏膜層及結(jié)腸黏膜下層可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)伴有隱窩增生。正常對(duì)照組結(jié)腸病理切片可見結(jié)腸組織上皮完整且黏膜光滑，黏膜層及黏膜下層無充血、水腫等表現(xiàn)；EGB 761組可見結(jié)腸組織上皮的破損不明顯，黏膜層及黏膜下層的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，隱窩增生形成不明顯，其炎癥程度較模型組明顯減輕，且EGB 761組結(jié)腸病理表現(xiàn)較模型組隱窩破壞、病變深度、炎癥浸潤(rùn)均有不同程度的減輕，見圖2。

圖1 各組小鼠DAI評(píng)分比較

A：模型組；B：正常對(duì)照組；C：EGB 761組

圖2各組動(dòng)物結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)的表現(xiàn)(HE染色×200)

2.3免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)腸黏膜claudin-1、occludin、 zo-1蛋白的定位分布 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，行冰凍切片熒光染色，claudin-1、occludin、zo-1等緊密連接蛋白的抗體均帶有熒光標(biāo)記物，claudin-1、occludin抗體帶有紅色熒光標(biāo)記物，zo-1抗體帶有綠色標(biāo)記物，通過熒光顯微鏡可見模型組結(jié)腸組織熒光染色后claudin-1、occludin陽性蛋白表達(dá)呈現(xiàn)紅色顯像，結(jié)腸組織細(xì)胞與細(xì)胞緊密連接處紅色熒光分布不連續(xù)、不整齊且較零亂，邊緣粗糙呈鋸齒狀；同時(shí)紅色顯色面積減少，且熒光強(qiáng)度減弱；正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜claudin-1、occludin陽性蛋白紅色熒光在結(jié)腸細(xì)胞與細(xì)胞連接處呈連續(xù)性分布、邊緣光滑，紅色顯色面積較大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；EGB 761組claudin-1、occludin陽性蛋白紅色熒光在結(jié)腸細(xì)胞與細(xì)胞連接處沿胞膜分布，呈連續(xù)性分布、邊緣較光滑，紅色顯色面積較模型組大，紅色熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組稍減弱，但仍強(qiáng)于模型組。通過熒光顯微鏡可見模型組結(jié)腸組織熒光染色后zo-1陽性蛋白表達(dá)呈現(xiàn)綠色顯像，結(jié)腸組織細(xì)胞與細(xì)胞緊密連接處紅色熒光分布不連續(xù)、不整齊且較零亂，邊緣粗糙呈鋸齒狀；同時(shí)綠色顯色面積減少，且熒光強(qiáng)度減弱；正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜zo-1陽性蛋白綠色熒光在結(jié)腸細(xì)胞與細(xì)胞連接處呈連續(xù)性分布、邊緣光滑，綠色顯色面積較大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；EGB 761組zo-1陽性蛋白綠色熒光在結(jié)腸細(xì)胞與細(xì)胞連接處沿細(xì)胞膜分布，呈連續(xù)性分布、邊緣較光滑，綠色顯色面積較模型組大，綠色熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組稍減弱，但仍強(qiáng)于模型組，見圖3～5。

A：模型組；B：正常對(duì)照組；C：EGB 761組

圖3各組小鼠結(jié)腸黏膜組織claudin-1的表達(dá)(免疫熒光染色×200)

A：模型組；B正常對(duì)照組；C：EGB 761組

圖4各組小鼠結(jié)腸組織occludin的表達(dá)(免疫熒光染色×200)

A：模型組；B正常對(duì)照組；C：EGB 761組

圖5各組小鼠結(jié)腸組織zo-1的表達(dá)(免疫熒光染色×200)

3 討 論

隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)也隨之改變，多方的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，UC的發(fā)病率較以前明顯上升，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，所以UC的治療成為亟待解決的問題。目前對(duì)于UC的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但是多數(shù)研究認(rèn)為更多的有害物質(zhì)或病毒穿過腸道的黏膜屏障，與機(jī)體本身的免疫系統(tǒng)反復(fù)地接觸及刺激，使機(jī)體的免疫發(fā)生異常變化，從而產(chǎn)生大量的免疫炎性因子，不斷刺激腸道，使腸道發(fā)生炎性反應(yīng)，造成腸道的黏膜水腫、出血、糜爛等癥狀。由此可見腸道的黏膜屏障起到了關(guān)鍵性的作用。

腸黏膜屏障在正常情況下是腸道的保護(hù)性屏障，它把有害物質(zhì)與機(jī)體分開，避免機(jī)體受到侵害，完整的腸道黏膜屏障是由腸道上細(xì)胞連接而成的，細(xì)胞與細(xì)胞之間有緊密連接蛋白，這種蛋白之間的緊密連接是其主要的連接方式，對(duì)細(xì)胞的連接及屏障形成的完整性起著決定性的作用[4-5]。在正常情況下，結(jié)腸組織黏膜能有效阻止有害菌穿透黏膜進(jìn)入深部組織，腸道黏膜上皮的完整性是腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有利于機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是機(jī)體健康的保證[6-9]。如果有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞之間的緊密連接蛋白造成損害，使細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接不緊密、不連貫，有破損、裂縫，使屏障的保護(hù)作用降低，此時(shí)有害物質(zhì)能穿過細(xì)胞之間連接的屏障對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)不斷地進(jìn)行刺激，引起機(jī)體免疫紊亂，炎癥產(chǎn)生，最終導(dǎo)致UC的發(fā)生。由此可見，緊密連接蛋白的連貫性、黏膜屏障的完整性，在腸道保護(hù)方面起著重要的作用。

西醫(yī)主要采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑治療UC，但是同時(shí)也會(huì)伴發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，給患者帶來了痛苦。在中醫(yī)方面關(guān)于UC的研究也較多，取得的成果也較顯著，銀杏是中國(guó)較為古老的一種植物，銀杏葉中含有苦內(nèi)酯、天然活性黃酮等對(duì)人體健康有益的多種成分，在UC的研究中也顯示了很大的作用。GBE 761具有擴(kuò)張血管、溶解膽固醇、改善血液循環(huán)、清除自由基、清除過氧化脂質(zhì)、保護(hù)組織等作用。也有研究表明，GBE 761可抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有抑制腸道炎癥，保護(hù)腸道作用，但在GBE 761治療UC的緊密連接蛋白的連貫性、黏膜屏障的完整性方面的研究較少。

綜上所述，應(yīng)用GBE 761干預(yù)UC小鼠可以使UC小鼠血便減少，腹瀉減輕，進(jìn)食增加，精神萎靡癥狀減輕，病理結(jié)果及免疫熒光檢查顯示，GBE 761干預(yù)UC小鼠可以恢復(fù)緊密連接蛋白的連貫性、減少緊密連接蛋白破損，使腸黏膜完整性增加，減少腸道出血，小鼠的進(jìn)食及體質(zhì)量逐漸增加，UC癥狀首先獲得改善。

[1]Dupont A,Kaconis Y,Yang I,et al.Intestinal mucus affinity and biological activity of an orally administered antibacterial and anti-inflammatory peptide[J].Gut,2015,64(2):222-232.

[2]Long TM,Nisa S,Donnenberg MS,et al.Enteropathogenic escherichia coli inhibits type Ⅰ interferon and RNase l-mediated host defense to disrupt intestinal epithelial cell barrier function[J].Infect Immun,2014,82(7):2802-2814.

[3]Michielan A,D′incà R.Intestinal permeability in inflammatory bowel disease:pathogenesis,clinical evaluation,and therapy of leaky gut[J].Mediators Inflamm,2015(2015):628157.

[4]Mccole DF.IBD candidate genes and intestinal barrier regulation[J].Inflamm Bowel Dis,2014,20(10):1829-1849.

[5]Coskun M.Intestinal epithelium in inflammatory bowel diseases[J].Front Med (Lausanne),2014(1):24.

[6]Sun T,Gao GZ,Li RF,et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation ameliorates oxidative stress and restores intestinal mucosal permeability in chemically induced colitis in mice[J].Am J Transl Res,2015,7(5):891-901.

[7]Liu XC,Xu JM,Mei Q,et al.Myosin light chain kinase inhibitor inhibits dextran sulfate sodium-induced colitis in mice[J].Dig Dis Sci,2013,58(1):107-114.

[8]Langhorst J,Wieder A,Michalsen A,et al.Activated innate immune system in irritable bowel syndrome?[J].Gut,2007,56(9):1325-1326.

[9]Kotakadi VS,Jin Y,Hofseth AB,et al.Ginkgo biloba extract EGB 761 has anti-inflammatory properties and ameliorates colitis in mice by driving effector T cell apoptosis[J].Carcinogenesis,2008,29(9):1799-1806.

ProtectiveroleofGingkoBilobaextractinintestinalmucosalbarrierofintestinalinflammationmouse*

ZhaoHongwei1,HeLili2,HanHua3,YueYuehong4,KangWei5,ZhuYeshan6,LiuJianping7△

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofGerontology;3.DepartmentofGynecology;4DepartmentofNeurology,HebeiProvincialPeople′sHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China;5.DepartmentofGastroenterology,XinleMunicipalHospital,Xinle,Hebei050700，China;6.DepartmentofSpleenandStomach,TangshanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tangshan,Hebei063000,China;7.DepartmentofSpleenandStomach,HebeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine;Shijiazhuang,Hebei050071,China)

ObjectiveTo investigate the protective role of Gingko Biloba extract (EGB 761) in intestinal mucosal barrier of intestinal inflammation model mouse.MethodsThirty mice were randomly divided into the control group,model group and EGB 761 group;the animal model was established;the general condition,body mass change,fecal occult blood and colon histopathological changes were observed,the expressions of occludin-1 proteins in colon tissue were detected by immunofluorescence.ResultsThe body mass in the model group appeared to decrease,drinking water and eating food were significantly decreased compared with that in the control group.However after the EGB 761 intervention,the body mass of the model mice was significantly risen again;little inflammatory cells infiltration could be seen in the EGB 761 group,the inflammatory degree was significantly alleviated compared with the model group.The fluorescence distribution of the claudin-1,occludin and zo-1 in colonic tissues of the model group was more disperse compared with the normal group,the fluorescence intensity was weakened with rough edge;after EGB 761 intervention,the fluorescence in the EGB7 61 group was distributed along with the cellular membrane,the intensity was slightly weakened compared with the normal control group,but was still stronger than that in the model group.ConclusionEGB 761 can improve the inflammatory reaction in mouse colonic tissue,its mechanism may be related with its strengthening the protective effect of intestinal mucosal barrier.

EGB 761;ulcerative colitis;acute stage animal model;intestinal mucosal barrier

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.006

R574.62

A

1671-8348(2017)27-3763-04

2016-11-08

2017-04-10)

河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2016180)。

趙紅偉(1979-),博士，主治醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:13603396653@163.com。