胡 益，張 迪，Wolfgang Schwarz

(1. 復(fù)旦大學(xué) 航空航天系，上海 200433;2. 上海市針灸機(jī)制與穴位功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433;3. 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究中心，上海 201203;4. 法蘭克福大學(xué) 生物物理學(xué)系，法蘭克福 60438)

大黃素對(duì)辣椒素誘導(dǎo)的TRPV1通道電流的抑制作用

胡 益1,2,3，張 迪1,2,3，Wolfgang Schwarz2,3,4

(1. 復(fù)旦大學(xué) 航空航天系，上海 200433;2. 上海市針灸機(jī)制與穴位功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433;3. 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究中心，上海 201203;4. 法蘭克福大學(xué) 生物物理學(xué)系，法蘭克福 60438)

本研究通過(guò)顯微注射技術(shù)將TRPV1 cRNA(1ng/nL)注射至非洲爪蟾卵母細(xì)胞(20nL/個(gè))體內(nèi)，放置于G-ORi培養(yǎng)液中，并在(19±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)表達(dá).同時(shí)利用灌流技術(shù)將不同濃度梯度的大黃素、辣椒素按照設(shè)計(jì)順序依次灌流進(jìn)入流動(dòng)腔，同時(shí)控制流速保證非洲爪蟾卵母細(xì)胞完全浸沒(méi)于流動(dòng)腔內(nèi).使用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄0.1,1.0,10.0,50.0μmol/L濃度梯度的大黃素對(duì)500nmol/L濃度的辣椒素激活TRPV1電流的影響.得到大黃素作用辣椒素激活TRPV1通道的抑制作用表現(xiàn)出濃度依耐性和電壓非依賴性，IC50=38μmol/L，Hill系數(shù)n=0.5.結(jié)果表明了大黃素對(duì)TRPV1位點(diǎn)的相互作用是負(fù)協(xié)同的，在天然藥物里面是一類比較弱的拮抗劑，且大黃素在ORi溶液中開始析出沉淀的濃度在50～60μmol/L之間.我們首次發(fā)現(xiàn)了大黃素能夠抑制TRPV1通道電流，這可能為開發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供理論基礎(chǔ).

TRPV1通道電流； 辣椒素； 大黃素； 鎮(zhèn)痛機(jī)制； 雙電極電壓鉗

TRPV1(Transient Receptor Potential Vanilloid subtype 1)通道蛋白被大量地發(fā)現(xiàn)分布在外周神經(jīng)系統(tǒng)的三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglion，DRG)、節(jié)狀神經(jīng)節(jié)中，這3類神經(jīng)節(jié)在人體疼痛傳遞中起著重要的作用[1].與此同時(shí)，TRPV1通道蛋白也被證實(shí)存在于人類和大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦神經(jīng)元中并參與疼痛的傳遞[2-3].基因敲除也證明了TRPV1通道蛋白在炎癥發(fā)生后的熱痛覺(jué)過(guò)敏起著核心的作用[4].大量的文獻(xiàn)均表明了TRPV1通道蛋白是參與中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)疼痛信號(hào)傳遞的分子整合體[5]，因此TRPV1通道成為了鎮(zhèn)痛藥物治療的重要靶標(biāo).

國(guó)產(chǎn)中藥大黃(Rhubarb)是歷年來(lái)《中國(guó)藥典》收載的常用鎮(zhèn)痛中藥[6]，它的鎮(zhèn)痛抗炎作用近年來(lái)被多次報(bào)導(dǎo)[7-9].大黃素(emodin)是大黃的主要有效成分[10]，有實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)應(yīng)用細(xì)胞電生理記錄到它能夠下調(diào)DRG細(xì)胞上TRPV1通道蛋白的表達(dá)[11]，然而并沒(méi)有揭曉出其鎮(zhèn)痛的機(jī)制.

本研究通過(guò)探討大黃素對(duì)辣椒素激活TRPV1通道電流的影響，探討其生理學(xué)和藥理學(xué)特征，并揭曉作用機(jī)制，解釋大黃這種鎮(zhèn)痛中藥能夠鎮(zhèn)痛的主要機(jī)理.

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 藥品和試劑

3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、二甲基亞砜(DMSO)、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)、硫酸慶大霉素(Gentamicin-sulfate)、辣椒素(分析標(biāo)準(zhǔn)品)，上海SIGMA-ALDRICH公司提供；大黃素(分析標(biāo)準(zhǔn)品)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；ORi(Oocyte Ringer’s)溶液： NaCl(90mmol/L)、KCl(2mmol/L)、CaCl2(2mmol/L)、MOPS(5mmol/L)均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；實(shí)驗(yàn)用水： 蒸餾去離子水(Distilled and Deionized Water, DDW).

1.1.2 動(dòng)物

非洲爪蟾(Xenopuslaevis)，由上海茂生生物科技發(fā)展有限公司提供.

1.1.3 基因組

TRPV1 cRNA(1ng/nL)，由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司及德國(guó)馬克斯普朗克生物物理實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.4 儀器

電壓鉗放大器(TURBO TEC-03X)，NPI electronics；示波器(TPS 1002)，Tektronix；描筆記錄儀(SERVOGOR 102)，Kipp&Zonen；顯微注射控制器(Micro4)，World Precision Instruments；渦旋振蕩器(QL-901)，Vortex；顯微拉制儀(PC-10, MF 830)，Narishige Group；顯微鏡(SMZ 1000)，Nikon Corporation；顯微鏡照明裝置(C-F/230)，Nikon Corporation；電極玻璃管(GB150TF-8P)，Science Products GmbH；分析天平(AB104-S)，Mettler Toledo.

1.2方法

1.2.1 非洲爪蟾卵母細(xì)胞的獲取

取爪蟾一只，首先將其置于MS-222溶液(1g/L的Triacin用蒸餾水稀釋獲得)中麻醉15min.隨后腹部向上放置于裝滿碎冰塊的手術(shù)盤上，在其下腹用無(wú)菌手術(shù)刀剪開0.5～1cm的開口，使用無(wú)菌鑷子取出足量卵母細(xì)胞.將2.5mg的膠原蛋白水解酶(collagenase)溶解到裝有10mL的ORi溶液的離心管中，使用無(wú)菌鑷子將整個(gè)卵母細(xì)胞團(tuán)撕成小的分散細(xì)胞團(tuán).使用移液管將分散細(xì)胞團(tuán)放入溶有膠原蛋白水解酶的離心管中，置于搖床上震蕩12h.溫度控制在(19±1)℃，轉(zhuǎn)速在65r/min.

1.2.2 TRPV1 cRNA的顯微注射與表達(dá)

精選出20～30個(gè)卵母細(xì)胞放置于帶有柵欄式固定槽的陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)，依次排開.待TRPV1 cRNA解凍后，使用顯微注射控制器吸入約1μL的cRNA，隨后每個(gè)細(xì)胞注射20nL的cRNA(1ng/nL).注射完成后，將卵母細(xì)胞放入含有抗生素G-ORi溶液的六孔培養(yǎng)皿中.未注射TRPV1 cRNA的卵母細(xì)胞也應(yīng)該單獨(dú)放入一個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)作為對(duì)照組，隨后置于(19±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)表達(dá).

1.2.3 主要溶液的配制

實(shí)驗(yàn)中所有的溶液都需配置在蒸餾去離子水中.我們主要測(cè)試的辣椒素、大黃素需溶解在DMSO溶液(DMSO已被證實(shí)不能夠激活TRPV1通道)中，配成10mmol/L的母液.然后各自分裝至小容量離心管中，放至-4℃冰箱，同時(shí)需要密封、避光保存，待實(shí)驗(yàn)需要時(shí)再稀釋使用.另外鑒于大黃素在配制4h后溶液出現(xiàn)降解的現(xiàn)象[12]，我們的大黃素測(cè)定實(shí)驗(yàn)均需在配制新鮮溶液4h內(nèi)完成，否則需重新配制新液測(cè)試.

1.2.4 辣椒素及大黃素電流的記錄

使用雙電極電壓鉗記錄： 1) 500nmol/L的辣椒素對(duì)注射TRPV1 cRNA(實(shí)驗(yàn)組)以及未注射(對(duì)照組)細(xì)胞膜電流的大??；2) 0.1，1.0，10.0，50.0μmol/L濃度的大黃素對(duì)500nmol/L辣椒素激活TRPV1通道電流的影響.同時(shí)使用描筆記錄儀記錄整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程.

1.2.5 大黃素析出濃度的測(cè)試

配備新鮮大黃素溶液(1,10,50,60,80和100μmol/L)，在4h內(nèi)取樣放置于4mL的離心管中，分別在普通室內(nèi)光源和暗室單一光源的情況下觀測(cè)大黃素溶液析出情況.

1.2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析軟件采用Origin Pro 9.0，該軟件可以提供數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以及曲線擬合功能.

2 結(jié)果與分析

2.1卵母細(xì)胞表達(dá)的合適時(shí)間

12h培養(yǎng)后，在卵母細(xì)胞上未檢測(cè)到任何激活電流.24h后，檢測(cè)到了合適的電流，并且卵母細(xì)胞的死亡率僅為5%～10%(見(jiàn)圖1(A)).36h時(shí)，檢測(cè)到的激活電流偏大，卵母細(xì)胞的死亡率為20%～30%(見(jiàn)圖1(B)).而當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到48h后，卵母細(xì)胞基本上全部死亡(見(jiàn)圖1(C)).因此卵母細(xì)胞在19℃條件下表達(dá)24h，是本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)細(xì)胞的合適時(shí)間.

圖1 非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)時(shí)間的分析測(cè)定Fig.1 Analytical determination of TRPV1 cRNA expression time in Xenopus laevis oocytes20ng TRPV cRNA(1ng/nL)注入卵母細(xì)胞內(nèi)(2015年4月10日)，19℃條件下表達(dá)(A)24h， (B)36h， (C)48h后卵母細(xì)胞的形態(tài).可以觀測(cè)到： (A)圖細(xì)胞狀態(tài)良好，(B)圖有部分細(xì)胞白化死亡，(C)圖大部分卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜已經(jīng)損壞不能夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

2.2TRPV1cRNA成功表達(dá)

通過(guò)對(duì)比辣椒素通入流動(dòng)腔后注射20ng TRPV1 cRNA(1ng/nL)的實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞與未注射TRPV1 cRNA的對(duì)照組卵母細(xì)胞(兩組均放置于19℃的培養(yǎng)箱表達(dá)24h)I-V曲線(見(jiàn)圖2(A)).可以得到注射組的卵母細(xì)胞在500nmol/L的辣椒素的刺激下能夠產(chǎn)生明顯的外向的L型TRPV1通道整流電流，這表明TRPV1 cRNA可能在卵母細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)了.且對(duì)照組在同樣加入辣椒素后沒(méi)有產(chǎn)生任何激活電流，這表明辣椒素不能夠激活卵母細(xì)胞自身內(nèi)在的任何通道.從圖中得到反轉(zhuǎn)電位ERev=-15mV，且在-50mV的鉗制電壓時(shí)內(nèi)向電流最大.

圖2 辣椒素誘導(dǎo)TRPV1通道電流的分析測(cè)定Fig.2 Analytical determination of capsaicin-induced TRPV1 current(A) 圓點(diǎn)●表示的是實(shí)驗(yàn)組加入500nmol/L的辣椒素后的電流變化，正方形■表示的是對(duì)照組加入500nmol/L的辣椒素后的電流變化，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取N=38，6次實(shí)驗(yàn)的平均值(±SEM)；(B) 正方形■表示加入辣椒素之前，三角形▲表示加入辣椒素時(shí)，圓點(diǎn)●表示用ORi溶液沖洗辣椒素之后細(xì)胞膜電流的大小，數(shù)據(jù)均取32次實(shí)驗(yàn)的平均值(±SEM)

2.3通入辣椒素前后細(xì)胞膜上的電流

此處探究的是細(xì)胞膜上電流的情況，目的是探究沖洗掉辣椒素后TRPV1通道能否從激活狀態(tài)返回到靜息狀態(tài).圖2(B)展示了500nmol/L辣椒素對(duì)TRPV1通道電流影響的I-V曲線.從圖中可以觀察到通入辣椒素前與洗掉辣椒素后細(xì)胞膜上的電流幾乎一致，在ORi溶液的清洗下辣椒素所激活的電流消失.因此TRPV1通道能從激活狀態(tài)返回到靜息狀態(tài)，整個(gè)激活過(guò)程是可逆的.

2.4大黃素對(duì)TRPV1電流抑制作用的濃度依賴性分析

我們測(cè)試0.1,1.0,10.0,50.0μmol/L的大黃素(以上濃度大黃素溶液均可以完全溶解，在實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行中沒(méi)有析出)對(duì)500nmol/L的辣椒素激活TRPV1通道電流的影響.將不加入大黃素的500nmol/L的辣椒素在-60mV鉗制電壓下的激活的電流數(shù)值作為參照數(shù)值(-1)，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理.最后得到了圖3所示的I-V曲線.

從圖3可以看出大黃素對(duì)辣椒素激活的TRPV1通道電流是具有抑制性的，且呈濃度依耐性，但當(dāng)濃度到達(dá)測(cè)試最大值50μmol/L的時(shí)候，對(duì)電流的抑制作用并不是很強(qiáng).另外當(dāng)鉗制電壓為-150mV至-60mV之間時(shí)，I-V曲線幾乎平行，這表明大黃素對(duì)電流抑制也可能不是電壓依耐性的.我們沒(méi)有使用高濃度的大黃素進(jìn)行測(cè)試，是因?yàn)楫?dāng)其濃度增加至60μmol/L的時(shí)候溶液中便開始析出大黃素的沉淀，無(wú)法保證實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn).

2.5大黃素對(duì)TRPV1電流抑制作用的電壓依賴性分析

取-60mV鉗制電壓下不同濃度大黃素所對(duì)應(yīng)的抑制電流大小的數(shù)值，將不加入大黃素的500nmol/L的辣椒素在-60mV鉗制電壓下的激活的電流大小作為標(biāo)準(zhǔn)化的參照數(shù)值(-1)，將其他數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化(用r辣椒素誘導(dǎo)電流表示)，并用Hill方程進(jìn)行數(shù)值擬合，得到了圖4所示的-60，-80和-100mV下的大黃素對(duì)辣椒素激活TRPV1通道電流的濃度濃度依賴性曲線.

圖3 0.1,1.0,10.0,50.0μmol/L的大黃素對(duì)500nmol/L的辣椒素激活TRPV1通道電流的I-V曲線Fig.3 Current-voltage dependencies of emodin on capsaicin-induced TRPV1 steady state current正方形■表示只加入500nmol/L辣椒素激活的TRPV1通道電流，圓點(diǎn)●、向上三角形▲、向下三角形、菱形分別表示0.1,1.0,10.0,50.0μmol/L大黃素加上500nmol/L辣椒素激活的TRPV1通道電流.數(shù)據(jù)分別取N=15,6,6,5,5次實(shí)驗(yàn)的平均值(±SEM)

圖4 -60,-80,-100mV鉗制電壓下大黃素對(duì)辣椒素激活TRPV1通道電流的濃度依賴曲線Fig.4 Dependence of TRPV1-mediated current on emodin concentration正方形■、圓形●、三角形▲分別表示在-60，-80，-100mV鉗制電壓時(shí)，0.1,1.0,10.0,50.0μmol/L大黃素條件下取6,6,5,5次實(shí)驗(yàn)的平均值(±SEM).利用Hill方程擬合數(shù)據(jù)得出IC50(拮抗劑半抑制濃度)均等于55μmol/L，且Hill系數(shù)也均等于0.5

可以得到在-60，-80和-100mV鉗制電壓下達(dá)到50%激活電流大小時(shí)對(duì)應(yīng)的大黃素的濃度均為55μmol/L，且Hill系數(shù)也均等于0.5，這也證實(shí)了大黃素作為拮抗劑在抑制辣椒素激活TRPV1通道電流時(shí)，分子結(jié)合在TRPV1通道位點(diǎn)上是負(fù)協(xié)同作用的.另外，在改變電壓情況下，IC50(拮抗劑半抑制濃度)均不發(fā)生變化，這表明大黃素抑制電流不是電壓依耐性的.

2.6大黃素對(duì)TRPV1電流抑制作用的可逆性分析

2.6.1 可逆性拮抗描筆曲線

我們可以得出0.1，1.0，10.0，50.0μmol/L的大黃素對(duì)500nmol/L的辣椒素激活TRPV1通道電流有濃度依賴的抑制作用.在每次灌流大黃素作用后，再用含500nmol/L辣椒素的G-Ori溶液洗脫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞電流恢復(fù)到大黃素作用之前.這提示大黃素在結(jié)合TRPV1位點(diǎn)后，不會(huì)一直保持結(jié)合的狀態(tài)，會(huì)隨著ORi的沖洗而離開位點(diǎn)，是可逆性拮抗.描筆曲線分析如圖5(見(jiàn)第370頁(yè))所示.

圖5 描筆曲線的分析Fig.5 Analysis of pen recording curves(A)同一個(gè)卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中0.1，1.0μmol/L的大黃素對(duì)500nmol/L的辣椒素激活TRPV1通道電流作用時(shí)的描筆曲線(2015年1月21日記錄).(B)同一個(gè)卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中10.0，50.0μmol/L的大黃素對(duì)500nmol/L的辣椒素激活TRPV1通道電流作用時(shí)的描筆曲線(2015年1月15日記錄).兩個(gè)細(xì)胞狀態(tài)很好，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行曲線未發(fā)生偏移，始終保持在中軸線上

2.6.2 可逆性拮抗I-V曲線

測(cè)量順序?yàn)椋?辣椒素(500nmol/L)第1次→ORi沖洗第1次→辣椒素(500nmol/L)+大黃素(0.1或50.0μmol/L)→ORi沖洗第2次→辣椒素(500nmol/L)第2次，依次測(cè)量每一步的細(xì)胞膜電流大小，得出圖6(A),(B)(見(jiàn)第370頁(yè))的結(jié)果.

圖6 大黃素的可逆性抑制作用Fig.6 Analysis of reversible antagonism of emodin(A)，(B)分別表示當(dāng)大黃素為0.1和50.0μmol/L時(shí),測(cè)量順序下每一步的I-V曲線.圖中正方形■表示只加入500nmol/L辣椒素激活的TRPV1通道細(xì)胞膜上的電流；圓點(diǎn)●表示ORi溶液沖洗后細(xì)胞膜上的電流；向上三角形▲表示500nmol/L辣椒素加上0.1或50.0μmol/L大黃素后激活的TRPV1通道細(xì)胞膜上的電流；向下三角形表示第2次ORi溶液沖洗后細(xì)胞膜上的電流；菱形表示第2次單獨(dú)加入500nmol/L辣椒素激活的TRPV1通道細(xì)胞膜上的電流.(A)或(B)數(shù)據(jù)分別都取N=3,5,3,5,3次實(shí)驗(yàn)的平均值(±SEM)

2.7大黃素析出沉淀的濃度

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到當(dāng)大黃素濃度增加至60μmol/L的時(shí)候溶液中便開始析出大黃素的沉淀，但在0至50μmol/L時(shí)，溶液則始終保持澄清狀態(tài)(見(jiàn)圖7).從圖7(A)中可以明顯地觀測(cè)到隨著大黃素濃度的增加，溶液顏色逐漸加深，其中1,10,50μmol/L樣品未見(jiàn)沉淀析出，而從60μmol/L開始逐漸觀測(cè)到有黃色絮狀沉淀生成，80,100μmol/L樣品的絮狀沉淀更是布滿了整個(gè)離心管.圖7(B)是在暗室中單一冷光源觀測(cè)到的大黃素樣品的情況，仍然可以得出1,10,50μmol/L樣品澄澈未見(jiàn)黃色絲絮狀沉淀析出，而60,80,100μmol/L樣品的絮狀沉淀隨著濃度的增大逐漸增多.因此可以得出大黃素沉淀開始析出的濃度在50μmol/L至60μmol/L之間.從這個(gè)析出點(diǎn)開始大黃素母液不能夠完全地溶解在ORi溶液中，也不能夠作為實(shí)驗(yàn)分析使用，因而無(wú)法繼續(xù)探討其作用機(jī)制.

圖7 大黃素(DMSO母液)在ORi中沉淀析出點(diǎn)的分析Fig.7 Analysis of precipitation point of emodin(DMSO stock solution) in ORi(A)普通室內(nèi)光源下觀測(cè)到1,10,50,60,80和100μmol/L的大黃素溶解情況.所有樣品溶液均從實(shí)驗(yàn)溶液中抽樣獲得(配備新鮮溶液后4h內(nèi)取樣)，放置于4mL的離心管內(nèi)對(duì)比觀察.(B)暗室單一冷光源下觀測(cè)到1,10,50,60,80和100μmol/L的大黃素溶解情況.所有樣品溶液均從實(shí)驗(yàn)溶液中抽樣獲得(配備新鮮溶液后4h內(nèi)取樣)，放置于4mL的離心管內(nèi)對(duì)比觀察

3 討 論

3.1TRPV1通道蛋白的成功表達(dá)

我們可以通過(guò)兩方面斷定TRPV1通道蛋白已經(jīng)成功地表達(dá)在了卵母細(xì)胞內(nèi).第一，注射TRPV1 cRNA組比對(duì)照組(未注射組)受辣椒素激活后產(chǎn)生的電流要高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)(圖2).對(duì)照組受辣椒素激活的電流幾乎為零，辣椒素不能夠激活卵母細(xì)胞自身內(nèi)在的任何通道.這可以說(shuō)明有外源性通道成功地表達(dá)在了卵母細(xì)胞內(nèi)，且能夠被辣椒素激活產(chǎn)生電流.第二，我們得出的I-V曲線的特征為外向L型整流(圖2(A))，跟其他研究者報(bào)導(dǎo)的均一致[13-15].以上都證實(shí)TRPV1已經(jīng)功能性地表達(dá)在了卵母細(xì)胞內(nèi).

3.2大黃素對(duì)辣椒素激活TRPV1通道電流的抑制作用

大黃素到達(dá)測(cè)試的最大濃度50μmol/L時(shí)，對(duì)辣椒素激活的電流并沒(méi)有表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗性(見(jiàn)圖3，圖4)，同時(shí)IC50為38μmol/L(見(jiàn)圖4)，表明大黃素為一種弱拮抗劑.另外大黃素跟育亨賓堿(yohimbine)(IC50=10～100μmol/L[16])的拮抗功能相當(dāng).這些都充分證明了大黃素在天然藥物里面的拮抗功能是比較弱的.此外，大黃素的抑制性也具有電壓非依賴性，對(duì)位點(diǎn)的相互作用是負(fù)協(xié)同的(見(jiàn)圖4).且作為TRPV1通道的另外一種拮抗劑同樣地表現(xiàn)出了抑制辣椒素激活過(guò)程的可逆性，導(dǎo)致TRPV1通道增敏的結(jié)果不明顯(見(jiàn)圖5，圖6).最后，當(dāng)大黃素濃度增加至60μmol/L后，觀測(cè)到實(shí)驗(yàn)溶液出現(xiàn)有黃色絮狀沉淀析出，而在50μmol/L時(shí)不存在此類情況(見(jiàn)圖7)，我們推測(cè)大黃素在ORi溶液中沉淀開始析出的濃度在50～60μmol/L之間.我們首次發(fā)現(xiàn)了大黃素能夠抑制TRPV1通道電流，提示其可能為開發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供理論基礎(chǔ).

3.3大黃素拮抗機(jī)制探討的展望

為了能夠繼續(xù)探討大黃素對(duì)辣椒素激活TRPV1通道電流的拮抗作用機(jī)制，我們需要解決高濃度大黃素(大于50μmol/L)析出的問(wèn)題.在圖7中，我們的樣品均在新鮮溶液配制后4h內(nèi)獲得，因此排除了大黃素發(fā)生降解的因素[12]，這需要討論大黃素的溶解度因素.由于大黃素極難溶解于水，因此在實(shí)驗(yàn)中我們將其首先溶解于DMSO中.據(jù)報(bào)道，DMSO能夠溶解大多數(shù)的有機(jī)物，這當(dāng)然包括大黃素，且DMSO屬于高極性的有機(jī)溶劑，能夠與任意比例水混合[17]，迄今為止尚未有文獻(xiàn)記載大黃素在DMSO中的具體溶解度.據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，大黃素也被證實(shí)是完全可溶于DMSO溶液的，但由于大量的DMSO溶劑對(duì)卵母細(xì)胞有致命性的傷害，不可能被使用在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行灌流.那么高濃度大黃素溶液的析出應(yīng)該是母液在ORi溶液中稀釋后發(fā)生的.我們尚不知大黃素在ORi溶液中的溶解度，但大黃素在另外一種類似于ORi的細(xì)胞培養(yǎng)液HBSS溶液中的溶解度(25℃)僅為0.014mg/mL[12]，可以推斷大黃素在ORi中的溶解度與這個(gè)數(shù)值應(yīng)該相差不大.另外還有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)大黃素在pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大[18]，但是當(dāng)細(xì)胞外界溶液的pH<6.3(H+)時(shí)，可以激活TRPV1通道[13]，因此采取降低pH值的方法并不可行.還有學(xué)者觀測(cè)到升溫(從0.5℃到49.9℃)可以顯著提升大黃素在乙醇或正辛醇中的溶解度[19]，然而大于43℃的傷害性熱刺激[20]也能夠激活TRPV1通道，且乙醇被報(bào)導(dǎo)為TRPV1的一種激活劑[21]，同時(shí)正辛醇不溶于水.在已報(bào)導(dǎo)的有機(jī)溶劑中，25℃下對(duì)大黃素溶解度最高的為甲醇(5.4mg/mL)、丙酮(8.1mg/mL)和二氯甲烷(13.5mg/mL)[12]，尚未有文獻(xiàn)記載這3種溶劑對(duì)卵母細(xì)胞的影響，但三者都皆有不同程度的毒性，且二氯甲烷只是微溶于水，因此可以考察的只有甲醇和丙酮.

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Abstract：Xenopuslaevisoocytes were selected and injected with 20 ng cRNA(at 1ng/nL) before the experiments, uninjected oocytes served as controls. The cells were stored at (19±1)℃ in G-ORi solution for incubation.Different gradient concentrations of emodin were perfused into chamber as arranged order in turns.Xenopuslaevisoocytes should be fully immersed in solutions under control of flow speed.Two-electrode voltage clamp was used to record the TRPV1 current activated by gradient concentrations of emodin. Inhibitory effects of 0.1, 1.0, 10.0, 50.0 μmol/L emodin on 500nmol/L capsaicin-induced TRPV1 currents have shown characters of concentration dependency and voltage independency as well, IC50=38μmol/L and Hill coefficientn=0.5. Results show emodin is a weak antagonist among natural compounds for TRPV1.The whole inhibition process is reversible, emodin exhibits no hypersensitization.Besides, sediment can be detected in the ORi solution when concentration of emodin reaches up to 50—60μmol/L. We suggest that the inhibition of TRPV1 may contribute to the analgesic effect ofRhubarbextracts, and emodin may form the basis for developing new analgesic drugs.

Keywords： TRPV1 current; capsaicin; emodin; analgesia mechanism; two-electrode voltage clamp

EmodinInhibitsCapsaicin-InducedTRPV1Current

HU Yi1,2,3, ZHANG Di1,2,3, Wolfgang Schwarz2,3,4

(1.DepartmentofAeronauticsandAstronautics,FudanUniversity,Shanghai200433,China; 2.ShanghaiKeyLaboratoryofAcupunctureMechanismandAcupointFunction,Shanghai200433,China; 3.ShanghaiResearchCenterofAcupunctureandMeridians,Shanghai201203,China; 4.InstituteforBiophysics,J.W.GoetheUniversity,FrankfurtamMain60438，Germany)

Q27

A

0427-7104(2017)03-0366-08

2016-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(81590950，81102630)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃 (2012CB518502)；上海市針灸機(jī)制與穴位功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助(14DZ2260500)

胡 益(1990—)，男，碩士研究生；張 迪(1980—)，女，副教授，通信聯(lián)系人，E-mail： dizhang@fudan.edu.cn.