張雪鈺，武軍凱，劉建珍，肖 嘯，張立彬

(河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

桃樹抗寒相關(guān)的葉綠體新基因PpRBD1的克隆及特征分析

張雪鈺，武軍凱，劉建珍，肖 嘯，張立彬*

(河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

為確定桃樹細(xì)胞質(zhì)抗寒相關(guān)基因，依據(jù)模式植物擬南芥中抗寒相關(guān)的RBD1基因，結(jié)合桃基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)并克隆到一個(gè)桃PpRBD1基因。該基因全長2 230 bp，編碼513個(gè)氨基酸；結(jié)構(gòu)域分析顯示，該氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守結(jié)構(gòu)域，是與擬南芥RBD1同源的蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，該基因編碼的蛋白可能在葉綠體中表達(dá)。該基因可能在桃抵抗寒冷脅迫中發(fā)揮重要作用。

桃；抗寒性；葉綠體；ppRBD1；RRM

我國桃樹栽培北線是北緯39°～40°地區(qū)，溫度是限制其地理分布的主要因素，桃樹在這些地區(qū)周期性發(fā)生凍害，給果樹生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。實(shí)踐證明，采用傳統(tǒng)的育種手段很難解決這一問題。因此，研究抗寒性的相關(guān)基因并將其用于抗寒新品種的培育具有十分重要的意義[1]。目前，對于桃樹抗寒性相關(guān)基因的研究主要集中在細(xì)胞核上。在桃上已經(jīng)研究的比較清楚的有CBF冷誘導(dǎo)途徑[2]、抗凍蛋白[3]等。對于桃樹細(xì)胞質(zhì)抗寒相關(guān)基因的研究鮮有報(bào)道。細(xì)胞質(zhì)抗寒性的研究多集中在模式植物上。研究表明，定位于線粒體和葉綠體中的RNA結(jié)合蛋白與植物的抗寒性有關(guān)。Kim等[4]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一種定位于線粒體的甘氨酸富集RNA結(jié)合蛋白，在低溫下含量顯著提高。Wang等[5]通過T-DNA插入的方式篩選擬南芥中的冷敏感突變體，得到在抗寒方面具有重要作用的基因RBD1，該基因是細(xì)胞核編碼的，而由其編碼的蛋白質(zhì)定位于葉綠體，是一種RNA結(jié)合蛋白，具有RRM基序。

模式植物細(xì)胞質(zhì)抗寒相關(guān)基因的研究為桃樹抗寒性的研究提供了重要理論依據(jù)。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，抗寒與不抗寒親本的正交與反交組合在F1代的抗寒程度的加權(quán)平均值具有顯著差異[6]。筆者試圖以桃為材料，通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的方法克隆桃中與擬南芥抗寒性密切相關(guān)的同源PpRBD1基因，比較不同品種桃該基因的序列并進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究其功能和探索RNA結(jié)合蛋白對抗寒性的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

表1 6個(gè)桃品種抗寒性及來源

注：抗寒性強(qiáng)品種用“+”表示；抗寒性差品種用“-”表示。

選用3個(gè)抗寒性強(qiáng)桃品種和3個(gè)抗寒性差桃品種為試驗(yàn)材料。其中，中華壽桃、琿春桃和21世紀(jì)桃取自河北省秦皇島市昌黎縣河北科技師范學(xué)院園藝試驗(yàn)站，雪桃取自河北省保定市滿城縣苗圃場，懷來毛桃和早霞露桃取自北京農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所(表1)。

pEASY-T5 Zero Cloning Kit，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell引自北京全式金生物技術(shù)有限公司。質(zhì)量濃度20 g/L的CTAB裂解液，1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，5 mol/L NaCl，β-巰基乙醇，乙醇，冰乙酸引自北京博邁德公司。DNA膠回收試劑盒引自Axygen。其余試劑均為北京化工廠的產(chǎn)品(分析純)。引物合成和測序工作由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 DNA的提取

采用改良的CTAB法提取葉片DNA[7]。具體步驟如下：

(1)向已預(yù)冷的研缽中加入0.5 g幼葉，加入液氮進(jìn)行充分研磨至粉末發(fā)白，立即用預(yù)冷的勺子轉(zhuǎn)入已加入700 μL CTAB提取液(0.5 mmol/L EDTA，1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，20 g/L CTAB，體積分?jǐn)?shù)為0.01的巰基乙醇)的1.5 mL離心管中。

(2)在漩渦振蕩器上充分混合后65 ℃水浴60 min，水浴過程中不斷輕輕晃動(dòng)直至搖勻。

(3)加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)至充分混勻，室溫下12 000 r/min離心10 min。

(4)上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管。

(5)重復(fù)步驟3和步驟4。

(6)加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，上下輕輕翻轉(zhuǎn)至充分混合，-20 ℃放置30 min后，12 000 r/min離心5 min，棄上清。

(7)得到的DNA沉淀用體積分?jǐn)?shù)為0.70的乙醇沖洗3次后，再加入無水乙醇沖洗1次，吸干殘存乙醇，超凈工作臺上晾干。

(8)干燥后加入100 μL RNase Free ddH2O水，彈起DNA使其充分溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因的克隆

根據(jù)Wang等[5]的相關(guān)研究，搜索擬南芥中該RNA結(jié)合蛋白的編碼基因(登錄號：BT005155)，根據(jù)相近物種保守區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。由于目標(biāo)序列過長，分2段進(jìn)行克隆測序。

P1:5’-GGAACTGACTCATTTTGCTCAGTAG-3’

P2:5’-TGCACTTTCTCATCAATCACTACC-3’

P3:5’-AGCAGGATGCAACTAGGTATGT-3’

P4:5’-GGGAAGAAGAGCATATTTCATTCAT-3’

對6個(gè)不同的桃品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：①2×Es Taq MasterMix 10 μL,P1(10 pmol/L) 0.5 μL, P2(10 pmol/L) 0.5 μL, DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL, RNase Free ddH2O 8.5 μL；②2×Es Taq MasterMix 10 μL,P3(10 pmol/L) 0.5 μL, P4(10 pmol/L) 0.5 μL, DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL, RNase Free ddH2O 8.5 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保持[8]。

回收擴(kuò)增片段并連接pEASY-T5載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1。PCR鑒定陽性菌由中美泰和生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 生物信息分析

利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進(jìn)行序列比對，并尋找同源基因和蛋白序列[9]。

利用DNAMAN軟件進(jìn)行桃不同品種的核酸序列拼接、分析和多序列比對。

利用ExPASy網(wǎng)站(http://www.expasy.org/)的在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析[10]。

利用LOCASIZER 1.0網(wǎng)站(http://localizer.csiro.au/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

蛋白質(zhì)序列預(yù)測，并利用NCBI網(wǎng)站的CDD在線分析軟件對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。

利用SWISS-MODEL在線分析工具(https://swissmodel.expasy.org/)對保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

利用MEGA5對13個(gè)物種的RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，各蛋白氨基酸的比對在ClustalW上進(jìn)行。進(jìn)化樹的構(gòu)建使用鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行，并用Bootstrap進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)設(shè)為500，其它參數(shù)選擇默認(rèn)值。

2 結(jié) 果

2.1 RBD基因的克隆

通過PCR擴(kuò)增，得到兩段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，引物P1和P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1 000 bp，引物P3和P4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1 500 bp(圖1)。將測得的序列拼接分析，得到2 230 bp的序列，將其提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(登錄號：KY744742)。

2.2 RBD基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1RBD基因序列的BLAST結(jié)果 利用NCBI網(wǎng)站的BLAST進(jìn)行序列比對，得到桃假定蛋白的mRNA序列(登錄號：XM_007222655)，全長819 bp與本實(shí)驗(yàn)的部分序列一致。通過編碼蛋白序列的預(yù)測分析，該序列與NCBI中的桃假定蛋白(登錄號：ONI30572.1)的氨基酸序列高度相似(圖2)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 PpRBD1基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.2.2不同桃品種比較 用DNAMAN對6個(gè)桃品種進(jìn)行基因序列和翻譯氨基酸序列的比較，發(fā)現(xiàn)琿春桃、21世紀(jì)桃、雪桃和早霞露桃在基因序列上與假定蛋白的mRNA完全一致。與這些品種的基因序列相比，中華壽桃和懷來毛桃在外顯子1區(qū)域的①158 bp(T→G)，②280 bp(A→C)，③465 bp(A→G)等3位點(diǎn)和內(nèi)含子2區(qū)域的④1 063 bp(T→A)以及外顯子3區(qū)域的⑤1 325 bp(C→T)和⑥1 761 bp(G→A)有單堿基差異。對應(yīng)的氨基酸在①52位(L→W)、②93位(A→C)和③305位(T→I)有單個(gè)氨基酸的差異。④位于內(nèi)含子區(qū)域，不編碼氨基酸，③和⑥處氨基酸發(fā)生簡并。結(jié)果表明，該基因在同一物種中保守性較強(qiáng)。2.2.3理化性質(zhì)分析 利用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam對PpRBD1編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析[11]。結(jié)果表明，該蛋白的理論分子量為56.547 kD，理論等電點(diǎn)為5.23，分子式為C2465H3956N678O815S13，脂肪族氨基酸指數(shù)74.09，親水性平均系數(shù)(GRAVY)-0.675，可能為親水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)44.61，根據(jù)Guruprasad方法表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。2.2.4LOCALIZER1.0蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測 LOCALIZER 1.0是一種基于葉綠體和線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及細(xì)胞核的NLSs(nuclear localization signals)特征預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位的工具[12]。植物細(xì)胞中有許多由細(xì)胞核基因編碼的，在不同的細(xì)胞區(qū)室執(zhí)行特定功能的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)往往具有專門的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。預(yù)測結(jié)果顯示，PpRBD1基因編碼的氨基酸序列中，1～28位為cTP(chloroplast transit peptides，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)，可信度0.919；還有2個(gè)NLS。

2.2.5CDD鑒定 利用DNAMAN對擬南芥RBD1基因和桃的PpRBD1基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對，氨基酸全序列相似性僅32.43%，但是202～288位相似性達(dá)71.26%。

選擇保守性較高的區(qū)域，利用NCBI中的CDD工具對保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。鑒定結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白在202～288位具有RRM結(jié)構(gòu)域，可能屬于RRM超家族。

2.2.6預(yù)測蛋白的保守結(jié)構(gòu)域的SWISS-MODEL同源建模 利用SWISS-MODEL對該基因的預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源建模，在202～288位得到預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)(圖3)。該結(jié)構(gòu)為β折疊和α螺旋形成的β1α1β2β3α2β4三明治結(jié)構(gòu)，空間上4個(gè)反向平行的β折疊按照β4β1β3β2的順序排列，與RRM結(jié)構(gòu)域一致[13]。

2.2.7進(jìn)化樹的構(gòu)建 利用MEGA5軟件，通過構(gòu)建RNA結(jié)合蛋白與其他生物中相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，以擬南芥作根，構(gòu)建有根樹(圖 4)。發(fā)現(xiàn)該蛋白的進(jìn)化與生物演化的方向一致，近源物種的遺傳距離較近，遠(yuǎn)源物種的遺傳距離較遠(yuǎn)，與桃(prunuspersica)同屬薔薇科的prunusmume、Malusdomestica和Fragariavesca在同一分支上。表明這些蛋白具有相同的起源，在生物漫長的演化過程中，在不斷地趨異進(jìn)化。

圖3 RRM保守結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 8個(gè)物種RNA結(jié)合蛋白進(jìn)化樹

3 討 論

植物響應(yīng)低溫脅迫的主要形式之一是通過形成穩(wěn)定的RNA二級結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的[14]。RNA結(jié)合蛋白與低溫脅迫的關(guān)系研究最早見于對大腸桿菌冷激蛋白(CSP)的報(bào)道中。大腸桿菌CSP在低溫脅迫下產(chǎn)生RNA結(jié)合蛋白，這些蛋白的三級結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)RNA冷激結(jié)合域(CSD)。低溫誘導(dǎo)下，mRNA和CSP蛋白水平升高，CSD和RNA結(jié)合，解開雙鏈DNA[15]。

植物上有些RNA結(jié)合蛋白對低溫誘導(dǎo)同樣有重要的作用。Kim等[4]研究表明在低溫脅迫下，擬南芥AtGRP2的含量顯著提高，有助于提高植物的抗寒性。該蛋白是甘氨酸富集RNA結(jié)合蛋白，定位于線粒體上。Kim等[16]研究擬南芥的RZ-1a，發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下其含量顯著提高。Wang等[5]對擬南芥的T-DNA插入的冷敏感突變體進(jìn)行了篩選和研究，鑒定出一種RNA結(jié)合蛋白(暫命名為RBD1)基因缺失的突變體在低溫脅迫下與野生型的抗寒性表現(xiàn)出差異。該基因定位于細(xì)胞核，為組成型表達(dá)，但是其編碼的RBD1蛋白定位于葉綠體，結(jié)合23S rRNA前體的3個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且在低溫下結(jié)合能力更強(qiáng)。因此，RBD1蛋白作用于23S rRNA的前提而影響葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯過程。

擬南芥中的RBD1蛋白具有538個(gè)氨基酸殘基，并含有一個(gè)RNA識別基序。RNA識別基序(RNA recognition motif,RRM)，又稱為RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA-binding domain,RBD)或核糖體蛋白結(jié)構(gòu)域(ribonucleoprotein domain,RNP)，在生物界中廣泛存在，包括原核生物和病毒，但是在真核生物中豐度最高，是真核生物最豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之一[13]。在植物中，RRM蛋白存在于葉綠體，參與葉綠體mRNA 3’末端的加工[17]。植物線粒體中也有發(fā)現(xiàn)，但是功能還不清楚[18]。

本次研究克隆桃基因組得到的PpRBD1基因經(jīng)過生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白由513個(gè)氨基酸殘基組成，具有RRM基序。根據(jù)模式植物擬南芥中相關(guān)的研究結(jié)論和蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測的結(jié)果，推測該基因編碼的蛋白由細(xì)胞核基因編碼后，表達(dá)在葉綠體中，在低溫下可能參與23S rRNA的剪切過程，進(jìn)而影響葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯的正常進(jìn)行。

[1] 郭學(xué)民，劉建珍，肖嘯，等.桃、杏和櫻桃樹抗寒性研究進(jìn)展[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，30(1)：1-9.

[2] Wisniewski M,Norelli J,Bassett C,et al.Ectopic expression of a novel peach (Prunuspersica) CBF transcription factor in apple (Malus×domestica) results in short-day induced dormancy and increased cold hardiness[J].Planta,2011,233(5):971-983.

[3] Wisniewski M,Webb R,Balsamo R,et al.Purification, immunolocalization, cryoprotective and antifrezze activity of PCA60: a dehydrin from peach (Prunuspersica) [J].Physiol Plant,1999,105(4):600-608.

[4] Kim J Y,Park S J,Jang B,et al.Functional characterization of a glycine-rich RNA-binding protein 2 inArabidopsisthalianaunder abiotic stress conditions[J].Plant J,2007,50(3):439-451.

[5] Shuai Wang,Ge Bai,Shu Wang,et al.Chloroplast RNA-Binding Protein RBD1 Promotes Chilling Tolerance through 23S rRNA Processing inArabidopsis[J].PLOS Genetics. 2016.

[6] 王彬彬.桃樹樹體抗寒性遺傳和抗寒基因的SSR標(biāo)記[D].秦皇島:河北科技師范學(xué)院,2012.

[7] 宋立琴.桃果實(shí)成熟期基因的SSR標(biāo)記與定位[D].秦皇島: 河北科技師范學(xué)院, 2010.

[8] 慕春歌.珊瑚菜葉綠體基因TrnV-M序列的PCR擴(kuò)增與分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016,44(33)：135-136,154.

[9] 王延禹，周雅卓，鄭大浩，等.高山紅景天雌株特異性SRAP標(biāo)記發(fā)掘及其關(guān)聯(lián)基因功能分析[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38(4)：283-291.

[10] Elisabeth Gasteiger,Alexandre Gattiker,Christine Hoogland,et al.ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis[J].Nucleic Acids Research,2003,DOI:10.1093/nar/gkg56

[11] 楊召恩,楊作仁,劉坤,等.一個(gè)亞洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(1):195-204.

[12] Jana S,Ann-Maree C,Kathleen D,et al.LOCALIZER:subcellular localization prediction of both plant and effector proteins in the plant cell[J].Scientific Reports,2017, 7:44 598, DOI:10.1038/srep44598.

[13] Maris C，Dominguez C，Allain F H.The RNA recognition motif, a plastic RNA-binding platform to regulate post-transcriptional gene expression[J]. FEBS Journal, 2005,272(9):2 118-2 131.

[14] 章鎮(zhèn),韓振海.果樹分子生物學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2012.

[15] Sasaki K,Kim M H,Imai R.Arabidopsis cold shock domain protein2 is a RNA chaperone that is regulated by cold and developmental signals[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,364(3):633-638.

[16] Kim Y O,Kang H.The role of a zinc finger-containing glycine-rich RNA-binding protein during the coldadaptation process inArabidopsisthaliana[J].Plant and Cell Physiology,2006,47(6):793-798.

[17] Schuster G,Gruissem W.Chloroplast mRNA 3′ end processing requires a nuclear-encoded RNA-binding protein[J].EMBO J,1991,10(6):1 493-1 502.

[18] Vermel M, Guermann B,Delage L,et al.A family of RRM-type RNA-binding proteins specific to plant mitochondria[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(9):5 866-5 871.

(責(zé)任編輯：朱寶昌，陳于和)

Abstract: The objective of this study was to clone a novel chloroplast gene ofPpRBD1 in peach (Prunuspersica) according toArabidopsisthalianaand peach genome data, and to analyze its correlation with cold tolerance. The full length ofPpRBD1 gene was 2 230 bp sequence, which encoded a deduced protein including 513 amino acid residues. The domain analysis revealed that the amino acid sequence contained a conserved RRM (RNA recognition motif) domain, which was a protein homologous to RBD1 inArabidopsisthaliana. Subcellular localization showed that it expressed possible in chloroplast. And it might play an important role in plant tolerance.

Keywords: peach (Prunuspersica); cold tolerance; chloroplast;PpRBD1; RRM

CloningandCharacterizationofaNovelChloroplastGenePpRBD1AssociatedwithColdToleranceinPeach(Prunuspersica)

ZHANG Xueyu, WU Junkai, LIU Jianzhen, XIAO Xiao, ZHANG Libin

(College of Horticulture Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600, China)

S662.1

A

1672-7983(2017)02-0012-06

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.02.003

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：31572093)。

*通訊作者，男，教授，碩士，碩士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：桃遺傳育種與分子生物學(xué)。E-mail:zhanglibin9364@163.com。

2017-05-08;修改稿收到日期2017-06-05

張雪鈺(1992-)，女，碩士研究生。主要研究方向：果樹遺傳育種與分子生物學(xué)。