劉 云， 曹 嵩， 李 科， 李三華， 宋長偉， 覃 成， 朱欣婷*,4

(1.遵義醫(yī)學院貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州遵義 563000 2.貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州遵義 563000 3.遵義醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義 563000 4.遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴州遵義 563000)

雙向電泳技術(2D)是蛋白組學研究過程中的常用技術，而蛋白質樣品的準確定量是做好雙向電泳的前提條件。常用的蛋白質定量方法有Bradford法和二辛可寧酸(BCA)法，兩者都是通過測定樣品吸光度值進行蛋白質的定量。但是由于雙向電泳蛋白質樣品在制備過程中會不可避免的引入硫脲、尿素、SDS、NP-40、Triton X-100等試劑，這些試劑易與Bradford法中的考馬斯亮藍(CBB)和BCA法中的二辛可寧酸反應顯色而影響蛋白質定量的準確性。因此，上述兩種常用的蛋白質定量方法不宜應用于2D實驗。鑒于此，GE和Bio-Rad公司各自研發(fā)出專屬于2D的蛋白質定量試劑盒。但是此類試劑盒價格昂貴，其售價為常規(guī)蛋白質定量試劑盒的10倍以上，且操作步驟繁瑣、耗時耗力。因此，建立一種快速、準確、成本低廉的雙向電泳蛋白質定量方法亟待研究人員的關注。

CBB屬于三苯甲烷類染料。Bradford于1976年發(fā)現(xiàn)CBB-G250(以下簡稱G250)與蛋白質結合后，其最大吸收波長會從465 nm轉移至595 nm[1]，由此建立了Bradford蛋白質定量法，并被廣泛應用于蛋白質定量實驗。CBB常用于聚丙烯酰胺凝膠染色[2 - 4]，也是Blue Native Page(BN-PAGE)電泳技術中不可或缺的染色劑[5]。Luo等[6]發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE電泳中的蛋白條帶經CBB染色后可在近紅外線下發(fā)出熒光。本課題組前期也報道了一種CBB凝膠染色聯(lián)合近紅外成像用于雙向電泳前的蛋白質定量的方法[4]。該方法的優(yōu)點是試劑兼容性好、定量準確，缺點是在定量過程中需要先進行凝膠電泳，再染色掃描定量，操作步驟略顯復雜。

在后續(xù)的研究工作中，本課題組發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白(BSA)溶液與G250混合后，在近紅外熒光成像系統(tǒng)680 nm波長下可以被激發(fā)出熒光(發(fā)射波長720 nm)，其熒光強度與蛋白質濃度之間具有良好的線性關系。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在上述蛋白質溶液中加入硫脲、尿素等2D樣品制備試劑后，并未影響到這種線性關系?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本課題組建立了一種基于近紅外成像法以96孔板為載體的蛋白質定量方法。該方法具有操作簡單、快速、重復性好，且成本低廉等優(yōu)點，既能用于普通蛋白質定量實驗，又適用于雙向電泳前蛋白質樣品的定量。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Li-Cor Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(美國，Gene公司)。

BSA、硫脲、尿素(美國，Sigma公司)； G250、CHAPS(美國，Amresco公司)；DTT、溴酚藍(美國，Bio-Rad公司)。實驗用水為超純水。

人胃腺癌SGC-7901細胞株，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 制備待測蛋白質樣品

以本實驗中雙向電泳蛋白質樣品的制備過程為例：取含人胃腺癌SGC-7901細胞培養(yǎng)瓶，PBS沖洗3次后胰酶消化，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。充分吹打后離心(800 r·min-1)，棄上清液。加入3 mL雙向電泳細胞裂解液(2 mol·L-1硫脲、7 mol·L-1尿素、65 mmol·L-1DTT、4% CHAPS、0.001%溴酚藍)，重懸后冰上超聲破碎，每次超聲運行10 s，暫停10 s，計5個循環(huán)。14 000 r·min-1，4 ℃，離心30 min。將上清液分裝后于-80 ℃保存，待測。

1.3 制備蛋白質-G250混合溶液

1.3.1制備模擬2D實驗的2D-BSA-G250溶液用上述雙向電泳細胞裂解液配制2 mg·mL-1的BSA溶液(2D -BSA溶液)，分別取0、5、15、25、35、50、75、100 μL加入到8支離心管，用超純水補足到1 mL(蛋白終濃度分別為 0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.15、0.2 mg·mL-1)。各管中再加入0.01% G250染液(即0.01% (m/V)G -250、4.5%(m/V)乙醇、8.5%(m/V)磷酸，下同) 5 mL，最終總體積為6 mL，充分混勻為雙向電泳BSA-G250混合溶液(2D -BSA-G250)。

1.3.2制備普通BSA-G250溶液用超純水配制2 mg·mL-1的BSA溶液，分別取0、5、15、25、35、50、75、100 μL加入到8支離心管，用超純水補足到1 mL(蛋白終濃度分別為 0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.15、0.2 mg·mL-1)。各管中再加入0.01%G250染液5 mL，最終總體積為6 mL，充分混勻為BSA-G250混合溶液(BSA-G250)。

1.3.3制備待測蛋白質-G250混合溶液按1.2取未知濃度的待測SGC-7901蛋白質樣品50 μL，用超純水補足1 mL，再加入0.01%G250染液5 mL，充分混勻為雙向電泳SGC-7901蛋白質-G250溶液(2D -SGC-7901-G250)。

1.4 上樣

取96孔板，每孔上樣300 μL蛋白質-G250混合溶液(上樣前充分混勻)，具體上樣情況見2.1。

1.5 掃描并框選熒光值

上樣完成后需馬上檢測。將96孔板置于LI-COR Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)進行掃描。掃描物品選擇microplate 2；focus offset選擇3.5 mm；曝光強度設為5.0；成像質量選擇medium；選擇700 channel(即680 nm波長通道)；選擇成像區(qū)域后運行掃描程序并框選熒光區(qū)域。

1.6 繪制標準曲線

統(tǒng)計各孔熒光強度，以BSA濃度為X軸，吸光度值為Y軸，將熒光強度和各孔BSA蛋白濃度做相關分析，擬合標準曲線的回歸方程。

1.7 計算未知樣品蛋白量

將待測蛋白樣品孔的熒光值代入回歸方程，即可計算出待測蛋白質的終濃度。待測樣品蛋白質的濃度(mg·mL-1)=蛋白質的終濃度×稀釋倍數(shù)。

2 結果與討論

2.1 掃描圖像

圖1所示為蛋白質-G250染液在680 nm波長下的掃描圖像。每個圓圈代表96孔板的一個孔。大矩形框為標曲樣品區(qū)：上排為2D -BSA-G250，下排為BSA-G250；兩排樣品從左到右濃度均分別為0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.15、0.2 mg·mL-1；小矩形框中的兩個孔為測試區(qū)：左孔為0.05 mg·mL-1的2D -BSA-G250；右孔為0.15 mg·mL-1的BSA-G250。箭頭所指孔為待測的2D -SGC-7901-G250。由圖1可見染液在近紅外下可被激發(fā)出熒光信號，其主要原因是CBB在600～800 nm的近紅外熒光波長下吸收光譜變化不大且信號相對較弱，但當其與蛋白質結合后，在680 nm左右時其熒光信號就會迅速增大[6]。需要注意的是混合后長時間放置會有聚集現(xiàn)象，因此最好在加樣5 min之內就掃描檢測，以減少誤差。

2.2 熒光值的線性分析

在圖1的基礎上框選熒光值得圖2。圖2中白色圓圈框出的區(qū)域即各孔蛋白質-G250混合溶液熒光所在區(qū)域；ID為樣品編號；數(shù)字代表每個樣品的熒光值。

圖1 蛋白質-G250溶液近紅外熒光成像圖(680 nm 通道)Fig.1 Near-infrared fluorescence imaging of protein-G250 solutions

圖2 蛋白質-G250溶液的近紅外熒光成像圖對應的熒光值Fig.2 Near-infrared fluorescence imaging and corresponding fluorescent intensity of protein-G250 solutions

將8個2D -BSA-G250樣品(大方框，上排)熒光值和對應的BSA蛋白濃度做相關分析，得標準曲線(圖3A)，其回歸方程為：Y=34.23X+0.949,R2=0.986(方程1)。將8個BSA-G250樣品(大方框，下排)熒光值和對應的BSA蛋白濃度做相關分析，得到標準曲線(圖3B)，其回歸方程為：Y=32.89X+1.001，R2=0.987(方程2)。從標準曲線可知，2D -BSA-G250和BSA-G250樣品的熒光值和蛋白質濃度之間均具有良好的線性關系，因此可以用于雙向電泳蛋白和普通蛋白的定量。

圖3 2D -BSA-G250(A)和BSA-G250(B)的校準曲線 Fig.3 Calibration curves showing the fluorescent intensity with the increasing concentration of 2D -BSA-G250(A) and BSA-G250(B)

2.3 相對誤差分析

將17號蛋白樣品孔(2D -BSA-G250)熒光值2.55代入方程1計算得蛋白質濃度為0.047 mg·mL-1，相對誤差為6%。將18號蛋白樣品孔(BSA-G250)的熒光值5.77代入方程2計算得到蛋白質濃度為0.141 mg·mL-1，相對誤差為6%。定量結果顯示， 2D -BSA-G250和BSA-G250 兩種樣品制備的標準曲線均具有良好的線性關系，且測定濃度值與實際濃度值偏差較小。因此，該方法可以用于包括2D實驗在內的蛋白質定量。

2.4 SGC-7901總蛋白質定量

將19號蛋白樣品孔(2D -SGC-7901-G250)的熒光值4.29代入方程1，計算得細胞總蛋白質濃度為0.098 mg·mL-1，則原液蛋白質濃度為0.098×20(稀釋倍數(shù))=1.96 mg·mL-1。

3 結論

本研究建立了一種基于近紅外成像法以96孔板為載體的蛋白質定量方法，與常規(guī)蛋白質定量方法比較，該方法具有獨特的優(yōu)勢：(1)與BCA法相比，不需37 ℃孵育30 min，蛋白質-G250混合溶液制備完成后即可上機掃描，實驗步驟簡化，操作方便。(2)與凝膠染色法相比，省去了SDS-PAGE這一步驟，因此能大幅減少每次定量實驗所需的時間；此外，以孔板(如96孔板)為載體，一次可檢測幾十個樣品，檢測通量是凝膠染色法的數(shù)倍。(3)與Bradford法相比，可適用于雙向電泳蛋白質樣品及某些試劑兼容性較差的蛋白質樣品濃度的測定，建立的方法使用范圍廣，實用性強。以上所述顯示，本文所建立方法省時易操作，樣本檢測通量大，且能排除干擾物影響，可用于雙向電泳在內的蛋白質樣品的快速定量。