張麗華， 郭主聲， 楊維青， 謝樹(shù)金， 陳軍劍， 王佳敏， 程志琴， 王 欣， 朱學(xué)海，王劍文， 王海卿， 黃 娟

2013－2014年圍產(chǎn)期孕婦攜帶B族鏈球菌的血清型與耐藥分析

張麗華1， 郭主聲1， 楊維青2， 謝樹(shù)金1， 陳軍劍2， 王佳敏2， 程志琴1， 王 欣2， 朱學(xué)海1，王劍文1， 王海卿1， 黃 娟2

目的對(duì)圍產(chǎn)期孕婦B族鏈球菌（GBS）攜帶株的血清型及藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。方法收集妊娠35～37周孕婦的陰道和直腸分泌物標(biāo)本，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定，并統(tǒng)計(jì)其陽(yáng)性率。采用凝集法進(jìn)行血清學(xué)分型，用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照2009版CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏結(jié)果，采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果2 533例圍產(chǎn)期孕婦進(jìn)行GBS的檢測(cè)，檢出GBS 264株，陽(yáng)性率10.4%（264/2 533）。并對(duì)153株菌進(jìn)行了血清分型，其中Ⅲ型占54.9%（84/153）、Ⅰa 型占 17.6%（27/153）、Ⅰb 型占13.1%（20 /153）；藥敏試驗(yàn)顯示：該菌對(duì)青霉素、頭孢曲松、萬(wàn)古霉素均敏感，對(duì)左氧氟沙星、紅霉素和克林霉素的耐藥率分別是32.9%、68.1%和62.1%；對(duì)不同血清型的耐藥情況分析發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型菌株對(duì)以上3種藥物的耐藥率明顯高于其他血清型菌株。結(jié)論孕婦陰道和直腸均為GBS的定植部位，建議應(yīng)對(duì)孕婦的陰道和直腸分泌物同時(shí)送檢以提高其檢出率；Ⅲ型是GBS主要的血清型；青霉素仍可作為孕產(chǎn)婦及新生兒治療GBS感染的首選藥物，GBS陽(yáng)性的孕產(chǎn)婦應(yīng)立即進(jìn)行干預(yù)治療，以保證圍產(chǎn)兒健康。

圍產(chǎn)期； B族鏈球菌； 血清型； 藥敏試驗(yàn)

Abstract: ObjectiveTo analyze the serotypes and antimicrobial susceptibility profile of GroupB Streptococcus(GBS) in perinatal pregnant women.MethodsThe vaginal and rectal specimens were collected from pregnant women at 35 to 37 weeks of pregnancy for culture and identification. The serotypes were analyzed using agglutination assay. Antimicrobial susceptibility testing was conducted by using Kirby-Bauer method, and interpreted according to 2009 CLSI breakpoints. The data were analyzed via WHONET 5.6 software.ResultsThe prevalence of GBS was 10.4% (264/2 533) in the 2 533 perinatal pregnant women.Serotype III, Ia and Ib was identi fi ed in 54.9% (84/153), 17.6% (27/153) and 13.1% (20/153) of the GBS, respectively. All the GBS isolates were susceptible to penicillin, ceftriaxone and vancomycin. But 32.9%, 68.1% and 62.1% of the isolates were resistant to levofloxacin, erythromycin and clindamycin, respectively.The antibiotic resistance rate of serotype III isolates to the above three antibiotics was signi fi cantly higher than the other serotypes.ConclusionsGBS may colonize both vagina and rectum of pregnant women. Vaginal and rectal secretions should be sampled simultaneously for better screening GBS.GBS serotype III was the predominant serotype. Penicillin can be used as the fi rst-choice treatment for GBS infections inpregnant women and newborns. GBS-positive pregnant women should be given the intervention treatment immediately to ensure the health of perinatal infants.

Key words:perinatal period; groupB Streptococcus; serotype; antimicrobial susceptibility test

B 族鏈球菌（Group BStreptococcus， GBS） 又稱 作 無(wú) 乳 鏈 球 菌（Streptococcus agalactiae），是一種條件致病菌。基于莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）抗原成分，目前GBS可分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ等10種血清型[1]。美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心（CDC）最新指南提倡對(duì)所有妊娠35～37周孕婦采集直腸和陰道拭子進(jìn)行 GBS分離培養(yǎng)[2]，培養(yǎng)陽(yáng)性者或存在其他危險(xiǎn)因素者（前一胎有過(guò)GBS感染，GBS菌尿，胎膜破裂≥18 h，胎齡≤37周，發(fā)熱等）于分娩開(kāi)始時(shí)接受抗生素預(yù)防性治療。本研究對(duì)2013－2014年在東莞東華醫(yī)院門(mén)診產(chǎn)檢的妊娠35～37周的孕婦進(jìn)行口頭告之并征得同意的情況下開(kāi)展了常規(guī)的GBS檢測(cè)及其藥物敏感性檢測(cè)，并對(duì)分離菌株進(jìn)行血清學(xué)分型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2013年1月1日－2014年12月31日在我院門(mén)診就診孕婦的陰道和直腸拭子的GBS分離株264株。

1.2 儀器 和試劑

法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK 32細(xì)菌鑒定儀，哥倫比亞血平皿和血MH瓊脂平皿購(gòu)自廣州市迪景微生物科技有限公司，藥敏紙片擴(kuò)散法、Todd-Hewrtt（T-H）培養(yǎng)基為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品，血清分型試劑購(gòu)自丹麥血清研究所（Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark）。

1.3 GBS的檢測(cè)

對(duì)孕期35～ 37周的圍產(chǎn)期孕婦進(jìn)行陰道和直腸分泌物標(biāo)本采集，將采集的陰道拭子和直腸拭子分別浸入2 mL處理液（內(nèi)含0.16 mg/mL慶大霉素的0.9%NaCl 溶液）中1 min；之后將其置于T-H肉湯管中進(jìn)行增菌培養(yǎng)18～24 h；再分別接種到哥倫比亞血平皿上，在5%～10% CO2孵箱35 ℃孵育18～24 h；觀察血平皿上菌落特點(diǎn)，挑取灰白色、圓形、半透明、中等大小、β溶血的可疑菌落作涂片鏡檢，把革蘭陽(yáng)性球菌且觸酶陰性的菌落做camp試驗(yàn)或采用VITEK 32細(xì)菌鑒定儀鑒定分離菌株。

1.4 GBS藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619，按CLSI 2009標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.5 血清分型試驗(yàn)

Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ 10 種乳膠凝集分型血清試劑，操作步驟及判讀方法參考試劑盒的說(shuō)明書(shū)。若菌株與10 種分型血清均不發(fā)生凝集，定義為不可分型（non-typeable，NT）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用WHONET 5.6軟件分析數(shù)據(jù)，用SAS9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法均為卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBS的檢出情況

對(duì)2 533例在我院門(mén)診就診的妊娠35～37周的孕婦進(jìn)行GBS檢測(cè)，GBS檢出陽(yáng)性的孕婦264例，陽(yáng)性率為10.4%（264/2 533）。2013年陽(yáng)性檢出率為11.3%（162/1 429），2014年為9.2%（102/1 104）。

2.2 GBS藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

所有菌株對(duì)青霉素和頭孢曲松、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺敏感，對(duì)紅霉素、克林霉素和左氧氟沙星耐藥率依次為 68.1%、62.1%和32.9%。GBS對(duì)7種常用抗菌藥物的敏感性結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 GB S的血清學(xué)分型

我們按每月50 %的比例抽取菌株做血清分型試驗(yàn)，以檢測(cè)不同季度或不同年份血清分型結(jié)果的差異。共檢測(cè)了153株，占58.0%（153/264），結(jié)果Ⅲ型為 54.9%（84/153）Ⅰa 型 17.6%（27/153）、Ⅰb 型13.1%（20 /153）、Ⅴ型6.5%（10 /153）、Ⅵ型 1.3%（2/153）、 Ⅷ 型 0.7%（1/153），NT5.9%（9/153），GBS血清型的分布見(jiàn)表2。

2.4 各種血清型的GBS對(duì)抗菌藥物的耐藥率

不同血清型GBS對(duì)抗菌藥物的耐藥率略有差異，除Ⅵ型外，Ⅲ型菌株對(duì)左氧氟沙星、紅霉素和克林霉素的耐藥率明顯高于其他血清型菌株。各種血清型的GBS對(duì)抗菌藥物的耐藥率見(jiàn)表3。

表1 2013－2014年GBS對(duì)抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 1 Antibiotic susceptibility pro fi le of groupB Streptococcusstrains in 2013 and 2014（%）

表2 GBS的血清型分布Table 2 Serotype distribution of groupB Streptococcusisolates[n（%）]

3 討論

GBS屬溶血鏈球菌，大約1/4健康成年女性陰道攜帶GBS，大多無(wú)癥狀。但該菌可通過(guò)產(chǎn)道上行引起子宮和胎膜感染，導(dǎo)致孕婦發(fā)生早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、胎兒發(fā)育不良、胎膜早破、死胎，也可引起絨毛羊膜炎、子宮內(nèi)膜炎、血流感染、泌尿道感染等[3]。有研究表明，產(chǎn)前GBS定植陽(yáng)性的孕婦，其嬰兒出現(xiàn)早發(fā)型GBS感染的概率是陰性婦女的25倍[4]。目前我國(guó)有關(guān)孕產(chǎn)婦GBS的定植情況尚無(wú)大樣本的流行病學(xué)資料。且因母親妊娠期間不進(jìn)行常規(guī)GBS感染調(diào)查，故產(chǎn)科僅能提供極少的相關(guān)感染病史，新生兒科醫(yī)師懷疑新生兒感染時(shí)進(jìn)行血培養(yǎng)才能發(fā)現(xiàn)病原菌[5]。普遍篩查35～37周孕婦的GBS定植和產(chǎn)時(shí)使用抗生素預(yù)防可大量降低新生兒早發(fā)性GBS感染。近年來(lái)，雖然早發(fā)性GBS感染比較少見(jiàn)，孕產(chǎn)婦GBS的定植率自上世紀(jì)70年代就很少變化[6]。2013－2014年我院在檢測(cè)的2 533份樣本中檢出GBS 264株，檢出率為10.4%，相仿于上海的11.2%[7]、濟(jì)南的9%[8]，低于南寧的29.2%[9]，高于廈門(mén)的2.8%[10]、北京的7.5%[11]，說(shuō)明不同地區(qū)存在一定的差異。這些差異的存在，除了社會(huì)因素外，很大的原因是對(duì)圍產(chǎn)期孕婦GBS的培養(yǎng)方法沒(méi)有統(tǒng)一的程序。我國(guó)孕婦陰道GBS 定植率較低的原因可能為：①培養(yǎng)技術(shù)欠佳。培養(yǎng)時(shí)未使用選擇性肉湯增菌培養(yǎng)基，而使用普通培養(yǎng)基導(dǎo)致約有50% 定植者出現(xiàn)假陰性結(jié)果；②GBS 定植有3 種形式：慢性帶菌、短暫帶菌和間歇帶菌，采樣時(shí) GBS 可能處于間歇狀態(tài)，導(dǎo)致假陰性結(jié)果；③未同時(shí)使用2 個(gè)拭子采集分泌物。應(yīng)采集直腸和陰道拭子各1 份同時(shí)送檢，培養(yǎng)陽(yáng)性率可較單一拭子高 40%；④拭子采集后未立即送檢。導(dǎo)致GBS死亡，出現(xiàn)假陰性結(jié)果[12]。我們采用陰道分泌物和直腸分泌物同時(shí)送檢，進(jìn)行標(biāo)本增菌前抗生素處理、增菌后培養(yǎng)鑒定的程序，對(duì)GBS的檢測(cè)實(shí)踐證明本研究建立的檢測(cè)圍產(chǎn)期孕婦GBS的程序可行，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

表3 各種血清型GBS對(duì)抗菌藥物的耐藥率Table 3 Antimicrobial susceptibility rate of groupB Streptococcusisolates in terms of serotypes（%）

本研究隨機(jī)抽取58.0%（153/264）GBS 菌株進(jìn)行了血清分型，結(jié)果顯示Ⅲ、Ⅰa、Ⅰb 和Ⅴ型為常見(jiàn)，分布與英國(guó)和南非等報(bào)道相似[13-14]，而與日本有較大差異[15]，與北京地區(qū)妊娠婦女定植GBS的血清型分布情況相似[16-17]。本研究血清型中Ⅲ型占54.9%，高于Lu 等[16]的41.8%、仝凈凈等[17]的32.1%及Ueno等[15]的16.2%；Ⅰa 型占17.6%低于Lu 等的21.4%、稍低于仝凈凈等的17.9%、高于Ueno等的14.6%；Ⅰb 型占13.1%，高于Lu等的11.9%、低于仝凈凈等的16.1%及Ueno等的18.6 %；Ⅴ 型占6.5%，均低于Ueno等的19.1%、Lu 等的14.9%、仝凈凈等的14.3%；Ⅵ型占1.3%、Ⅷ型占0.7%均低于Ueno等的Ⅵ14.9%、Ⅷ型10.4%；未分型占5.9%；未檢測(cè)出Ⅱ型、Ⅳ型、Ⅶ型和Ⅸ型。Ⅲ 型毒力最強(qiáng)[18]，可產(chǎn)生多種外毒素和溶組織酶，引起嚴(yán)重感染 ，深圳市的研究也顯示發(fā)生嚴(yán)重侵襲性GBS感染的病例以血清Ⅲ型為主[19]。提示若孕婦攜帶了GBS菌株，對(duì)新生兒生命的安全存在危險(xiǎn)；目前育齡婦女接種GBS 疫苗是預(yù)防新生兒GBS 感染的理想策略，莢膜多糖是GBS 菌株的主要毒力因子，也是制備疫苗的基礎(chǔ)。正在研發(fā)的多價(jià)疫苗主要覆蓋Ⅲ、Ⅰa、Ⅰb 、Ⅱ和Ⅴ型5種血清型。本研究結(jié)果顯示，東莞GBS血清型以Ⅲ型為主，Ⅲ型、Ⅰa型和Ⅰb型的總和占所有血清型的85.6%（131/153），通過(guò)檢測(cè)分析，不同季節(jié)、不同年份GBS的血清分型，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.996）。提示多價(jià)疫苗可覆蓋東莞GBS 感染株的92.2%，能有效預(yù)防東莞育齡婦女感染GBS，減少定植，從而減少孕產(chǎn)婦和新生兒GBS 感染。

多數(shù)報(bào)道GBS對(duì)青霉素和氨芐西林敏感。孕婦分娩時(shí)使用該2種藥可有效預(yù)防感染。青霉素是一線治療藥物，因其是窄譜抗生素，抗GBS活性強(qiáng)，在患者對(duì)青霉素可能過(guò)敏時(shí)，可考慮應(yīng)用頭孢菌素類(lèi)藥物，其有較低的過(guò)敏率，同時(shí)能達(dá)到較高的羊膜內(nèi)濃度；若患者對(duì)青霉素高度過(guò)敏時(shí)，考慮使用紅霉素或克林霉素。美國(guó) CDC 和美國(guó)孕產(chǎn)婦協(xié)會(huì)最近修訂了指南[6]，克林霉素的耐藥率日益增加，大概從 3%增至15% ，紅霉素從7%增至25% 。青霉素即使過(guò)敏也不再推薦使用紅霉素。本研究的結(jié)果與大多數(shù)報(bào)道一致，GBS對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、糖肽類(lèi)抗菌藥物均呈高度敏感，未發(fā)現(xiàn)GBS對(duì)青霉素類(lèi)敏感性下降的現(xiàn)象，本研究中GBS對(duì)紅霉素耐藥率為68.1%，低于北京、深圳[17,19]，高于浙江、天津[20-21]地區(qū)的報(bào)道；對(duì)克林霉素耐藥率為62.1%，低于北京、深圳、浙江[17,19-20]，高于天津[21]地區(qū)的報(bào)道；對(duì)左氧氟沙星耐藥率為32.9%，低于北京、浙江[17,20]，高于深圳、天津[19,21]地區(qū)的報(bào)道。表3顯示各種血清型GBS對(duì)抗菌藥物的耐藥率有所不同，6種血清型對(duì)于左氧氟沙星和克林霉素的耐藥率有顯著差異（P=0.001和P=0.012）；同時(shí)還顯示Ⅲ型菌株對(duì)克林霉素與Ⅰa型及Ⅰb型相比有顯著差異、Ⅲ型菌株對(duì)左氧氟沙星與Ⅰa型、Ⅰb型及Ⅴ型相比均有顯著差異，值得引起高度重視。本研究顯示，青霉素類(lèi)抗生素仍是東莞地區(qū)預(yù)防和治療GBS感染的首選藥物?？咕幬锏哪退幝矢鞯鼐幌嗤瑪y帶的菌株血清型的不同，患者若對(duì)青霉素過(guò)敏，考慮使用紅霉素或克林霉素時(shí)，要參考患者攜帶菌株的藥敏結(jié)果。

多種血清型的存在及其分布的復(fù)雜性，成為制造有效疫苗和預(yù)防新生兒GBS感染的主要障礙。監(jiān)測(cè)圍產(chǎn)期孕婦GBS的感染狀況，并進(jìn)行血清分型，對(duì)提高GBS感染的預(yù)防和治療，保證母子健康有重要意義。本研究了解GBS血清型分布及對(duì)抗菌藥物敏感情況，對(duì)預(yù)防新生兒GBS感染及積極有效的治療提供了重要理論依據(jù)。

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Serotypes and antimicrobial resistance profile of the Group B Streptococcus isolates in perinatal pregnant women during the period from 2013 to 2014

ZHANG Lihua, GUO Zhusheng, YANG Weiqing, XIE Shujin, CHEN Junjian, WANG Jiamin, CHENG Zhiqin,WANG Xin, ZHU Xuehai, WANG Jianwen, WANG Haiqing, HUANG Juan. （Department of Laboratory Medicine, Donghua Hospital, Dongguan Guangdong 523110, China）

R378.12

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0527-05

10.16718/j.1009-7708.2017.05.008

2016-09-27

2017-04-27

2 0 1 4年廣東省東莞市社會(huì)科技發(fā)展項(xiàng)目（2014108101002）。

1. 東莞東華醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523110；

2. 廣東醫(yī)科大學(xué)臨床微生物學(xué)教研室。

張麗華（1949—），女，主任技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)及細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)。

張麗華， E-mail：13538684247@163.com。