杜 娜， 卯 建， 劉淑敏， 牛 敏， 堯 靜， 張孟爽， 杜 艷

產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌整合子和插入序列共同區(qū)1檢測及分型

杜 娜， 卯 建， 劉淑敏， 牛 敏， 堯 靜， 張孟爽， 杜 艷

目的研究臨床分離產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌中整合子和插入序列共同區(qū)1（ISCR1）移動元件的分布和攜帶耐藥基因盒情況，以及菌株的同源性。方法收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年6月－2014年10月產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌18株，采用VITEK 2全自動藥敏鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)； PCR及測序法檢測Ⅰ～Ⅲ類整合酶基因和ISCR1元件保守區(qū)，以及可變區(qū)攜帶的耐藥基因盒；采用脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術(shù)對菌株進(jìn)行分型研究。結(jié)果檢測菌株中77.8%（14/18）菌株Ⅰ類整合子保守區(qū)陽性，27.8%（5/18）菌株ISCR1元件保守區(qū)陽性，未檢測到Ⅱ、Ⅲ類整合子；72.2%（13/18）菌株Ⅰ類整合子可變區(qū)陽性，未檢測到ISCR1元件的可變區(qū)；整合子可變區(qū)含有編碼對氨基糖苷類抗生素耐藥的基因盒（aadA1、aadA5、aac（6'）-Ib-cr）和編碼對磺胺類抗菌藥物耐藥的基因盒（dfrA、dfrA15、dfrA17），可變區(qū)基因盒未檢測到NDM-1耐藥基因；PFGE分型將18株菌分成17種型。結(jié)論產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌克隆播散趨勢不明顯，Ⅰ類整合子廣泛存在于此類菌中，ISCR1元件攜帶率較低，并且這兩類移動元件與我院NDM-1基因的傳播無關(guān)。

整合子； 插入序列共同區(qū)1； 產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌； 克隆傳播

Abstract: ObjectiveTo investigate the distribution of integrons and ISCR1 elements in NDM-1-producingCitrobacter freundiiisolates, and analyze the genotypes of these strains to understand their homology.MethodsA total of 18 strains of NDM-1-producingCitrobacter freundiiwere collected from the First Af fi liated Hospital of Kunming Medical University during the period from June 2012 and October 2014. The isolates were identi fi ed and subjected to antimicrobial susceptibility testing with VITEK 2 System. Class I, II, and III integrons and ISCR1 elements were detected by PCR. Clonal relatedness was assessed by pulsedfi eld gel electrophoresis (PFGE).ResultsMost (77.8%, 14/18) strains were positive for class I integron conserved region, 27.8%(5/18) isolates were positive for ISCR1 conserved region. No class II or III integron was detected. Most (72.2%, 13/18) isolates were positive for class I integron variable region. None of the strains harbored class II integron or ISCR1 variable region. Integron variable regions included gene cassette encoding resistance to aminoglycosides (aadA1,aadA5,aac(6’)-Ib-cr) and trimethoprim-sulfamethoxazole (dfrA,dfrA15,dfrA17). PFGE revealed 17 clusters among 18 NDM-1-producingCitrobacter freundiiisolates.ConclusionsThe clonal dissemination of NDM-1-producingCitrobacter freundiiisolates is not signi fi cant. Class I integron is prevalent in NDM-1-producingCitrobacter freundii. The presence of ISCR1 is relatively rare. The two mobile elements are not related to the spread ofNDM-1 gene in this hospital.

Key words:integron; insertion sequence common region-1; NDM-1-producingCitrobacter freundii; clonal dissemination

弗勞地枸櫞酸桿菌屬腸桿菌科細(xì)菌，是重要的醫(yī)院感染病原菌，可引起腹瀉、腦膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染[1]。碳青霉烯類抗生素如亞胺培南和美羅培南等是治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）和產(chǎn)AmpC酶腸桿菌科細(xì)菌引起感染的最后一道防線，但是，隨著該類抗生素的大量使用，該防線已經(jīng)被各種產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌突破，嚴(yán)重地限制了臨床用藥選擇。細(xì)菌可產(chǎn)生新德里金屬β內(nèi)酰胺酶-1（New Delhi metallo-beta-lactamase1，NDM-1）會對除單環(huán)酰胺類抗生素外的幾乎所有抗生素都耐藥[2]。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌耐藥性快速播散的原因之一，整合子和插入序列共同區(qū)（insertion sequence common region， ISCR）元件是耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的重要元件。本研究擬通過對18株產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌進(jìn)行整合子和ISCR1元件的檢測，明確耐藥基因盒的攜帶情況，通過脈沖場凝膠電泳（pulsed fi eld gel electrophoresis，PFGE）分型研究，明確克隆播散趨勢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年6月－2014年10月產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌18株，在本課題前期研究中采用改良的Hodge試驗(yàn)、金屬酶（MBL）表型確證試驗(yàn)以及PCR法檢測NDM-1，通過VITEK 2進(jìn)行菌株鑒定。菌株來源于尿液標(biāo)本，集中在移植中心（12株），干療科（3株），泌尿外科（1株），神經(jīng)外科（1株），中醫(yī)科（1株）。沙門菌H9812菌株由俞云松教授惠贈，質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC25922由本科室保存。

1.1.2 試劑 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）所用試劑及5×TBE（TIANGEN公司），低熔點(diǎn)膠和AgaroseⅢ膠（上海生工公司），蛋白酶K（美國Sigma公司），XbaⅠ內(nèi)切酶（美國Promega公司）。

1.1.3 儀器 VITEK 2全自動微生物鑒定及藥敏分析儀及配套GN、GN14板卡（法國生物梅里埃公司），CO2培養(yǎng)箱（昆明友寧科技公司），1G603二級生物安全柜（美國Baker公司），SW-CJ-1 F超凈工作臺（中國 蘇州凈化設(shè)備公司），MyCycler TM thermalCycler DNA擴(kuò)增儀、Power Pac3000型電泳儀、CHEF Mapper XA脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），紫外分光光度計(jì)（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)。通過紙片擴(kuò)散法復(fù)核細(xì)菌對亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲唑和阿米卡星的藥敏結(jié)果。藥敏結(jié)果的判讀參照2014年CLSI M100-S24標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2PCR法檢測整合子和ISCR1元件的保守區(qū)和可變區(qū) 煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA，PCR法擴(kuò)增Ⅰ～Ⅲ類整合子和ISCR1元件的保守區(qū)及Ⅰ類整合子和ISCR1的可變區(qū)，引物見表1[3-6]。反應(yīng)總體系為 25 μL ：DNA 模板 1 μL，2×TaqPCR Master MIX 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL。Ⅰ～Ⅲ整合酶基因擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min ；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)； 72 ℃ 10 min； ISCR1元件的保守區(qū)擴(kuò)增的退火溫度為55 ℃，其余條件同整合子。Ⅰ類整合子可變區(qū)基因擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35 個循環(huán) ；72 ℃10 min； ISCR1元件的可變區(qū)擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果顯示陽性時將擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京諾賽基因公司進(jìn)行測序分析。

1.2.3PFGE分型 對產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌進(jìn)行PFGE分子分型。取在MH平皿上純培養(yǎng)后的細(xì)菌調(diào)配菌液，紫外分光光度計(jì)測得的590 nm處吸光度值（D）0.8～1.0為宜[7]，將菌液與2%低熔點(diǎn)膠以1∶1比例進(jìn)行細(xì)菌的包埋，再經(jīng)過蛋白酶K消化及內(nèi)切酶XbaⅠ酶切，最后PFGE電泳條件：6 V/cm，初始轉(zhuǎn)換時間為5 s，最終轉(zhuǎn)換時間為40 s，14 ℃，電場角度120°，0.5×TBE，總時間22 h；PFGE條帶的判讀參照Tenovel等[8]提出的標(biāo)準(zhǔn)。PFGE所用標(biāo)志物為沙門菌Braenderup血清型H9812菌株經(jīng)XbaⅠ內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)物[9]。

表1 整合子和ISCR1擴(kuò)增引物Table 1 The primers for amplifying integrons and insertion sequence common region 1

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

18株菌對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類抗生素的耐藥率高達(dá)100%，對氨曲南、慶大霉素、甲氧芐啶-磺胺甲 唑、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星和呋喃妥因耐藥率分別為66.7%、66.7%、66.7%、61.1%、61.1%、33.3%和11.1%。

2.2 整合子和ISCR1元件保守區(qū)及可變區(qū)檢測結(jié)果

77.8 %（14/18）的菌株Ⅰ類整合子保守區(qū)陽性，27.8%（5/18）的菌株ISCR1元件保守區(qū)陽性，未檢測到Ⅱ類、Ⅲ類整合子。72.2%（13/18）的菌株Ⅰ類整合子可變區(qū)陽性，未檢測到ISCR1元件的可變區(qū)；測序后經(jīng)BLAST對比發(fā)現(xiàn)整合子可變區(qū)含有編碼對氨基糖苷類抗生素耐藥的基因 盒（aadA1、aadA5、aac（6'）-Ib-cr） 和 編 碼對磺胺類抗菌藥物耐藥的基因盒（dfrA、dfrA15、dfrA17），基因盒的排列為：dfrA-aadA1， aac（6’）-Ib-cr，dfrA15，aadA1，dfrA17-aadA5，可變區(qū)基因盒未檢測到NDM-1耐藥基因。

2.3 PFGE分型結(jié)果

PFGE分型將18株菌分成17種型，其中有2株（10和12）為同一型，其余菌株各成一型，表明這些菌株克隆傳播趨勢不明顯，見圖1。

圖1 部分菌株脈沖場凝膠電泳圖Figure 1 Pulsed- fi eld gel electrophoresis of XbaI-digested DNA of selectedCitrobacter freundiiisolates

3 討論

弗勞地枸櫞酸桿菌是醫(yī)院獲得性感染常見的革蘭陰性桿菌之一，由于其固有產(chǎn)頭孢菌素酶的特性，對臨床常用抗感染藥物如廣譜β 內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，但對碳青霉烯類藥物仍保持敏感。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，臨床上出現(xiàn)了碳青霉烯類耐藥弗勞地枸櫞酸桿菌。本課題前期對碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行耐藥機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)了18株產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌，為進(jìn)一步了解其傳播規(guī)律，我們對其進(jìn)行整合子及ISCR1元件的檢測，并分析了其克隆傳播趨勢。

藥敏結(jié)果顯示菌株對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等抗菌藥物均高度耐藥，但是對阿米卡星仍保持敏感，與之前報道不相符[10-11]。隨后我們采用紙片擴(kuò)散法對阿米卡星的藥敏結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，發(fā)現(xiàn)2種方法呈現(xiàn)的藥敏結(jié)果相同。Wang等[12]對產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌進(jìn)行耐藥性的檢測發(fā)現(xiàn)其對所有β 內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥，但是對阿米卡星敏感，與我們的報道相符。

碳青霉烯類耐藥基因得以快速傳播的原因之一在于它們可以以整合子和ISCR1等移動元件為載體，在同種或不同種細(xì)菌間傳播[13]。本研究在77.8%（14/18）產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌中檢出Ⅰ類整合子，可見Ⅰ類整合子在產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌中分布廣泛。Ⅰ類整合子的可變區(qū)陽性率為72.2%，測序后經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)整合子可變區(qū)含有編碼對氨基糖苷類抗生素耐藥的基因盒（aadA1、aadA5、aac（6'）-Ib-cr）和編碼對磺胺類耐藥的基因盒（dfrA、dfrA15、dfrA17），未檢測到NDM-1耐藥基因，這表明整合子參與細(xì)菌多重耐藥的形成，但NDM-1基因可能位于其他傳播元件上如質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等。

產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌具有多重耐藥性以及NDM-1基因的傳播性，因此，對該種菌進(jìn)行分型具有重要的分子流行病學(xué)意義。本研究采用PFGE分型方法對產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌進(jìn)行分型發(fā)現(xiàn)18株菌株可被分為17型，這表明我院產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌克隆流行趨勢不明顯，但是其中有2株屬于同一型，為防止其大范圍的克隆播散，應(yīng)積極監(jiān)測該型克隆株。

盡管我們在整合子及ISCR1元件中未發(fā)現(xiàn)NDM-1基因，但是發(fā)現(xiàn)了編碼對氨基糖苷類和磺胺類抗菌藥物的耐藥基因盒，可見，整合子在細(xì)菌多重耐藥和耐藥傳播中發(fā)揮著重要作用。因此，積極研究臨床分離菌株中整合子和基因盒的種類及結(jié)構(gòu)，對了解細(xì)菌耐藥進(jìn)而控制細(xì)菌耐藥有著重要意義。此外，產(chǎn)NDM-1弗勞地枸櫞酸桿菌潛在的克隆流行株應(yīng)引起我們的高度重視。

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Detection of integrons and ISCR1 in and genotyping of NDM-1-producing Citrobacter freundii

DU Na, MAO Jian, LIU Shumin, NIU Min, YAO Jing, ZHANG Mengshuang, DU Yan. （Department of Laboratory Medicine, the First Af filiated Hospital of Kunming Medical University, Yunnan Institute of Laboratory Diagnosis, Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine, Kunming 650032, China）

R378.2

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0523-04

10.16718/j.1009-7708.2017.05.007

2017-02-10

2017-03-30

云南省醫(yī)療衛(wèi)生單位內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)科研項(xiàng)目（2016NS030）；昆明醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（2016570）。

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南省實(shí)驗(yàn)診斷研究所，云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032。

杜娜（1989—），女，碩士研究生，從事細(xì)菌耐藥基因傳播機(jī)制研究。

杜艷，E-mail：duyan_m@139.com。