王方舟， 倪文濤， 崔俊昌

·綜述·

抗菌藥物亞抑菌濃度及其臨床意義

王方舟， 倪文濤， 崔俊昌

亞抑菌濃度； 最小選擇濃度； 細菌； 耐藥

隨著抗生素的廣泛應用，細菌的耐藥性越益嚴重，而新抗生素的研發(fā)速度卻在明顯下降[1-2]，這使得細菌耐藥，尤其是多重耐藥成為目前威脅人類健康嚴重的公共衛(wèi)生問題。為了抑制細菌耐藥的產(chǎn)生和發(fā)展，制定臨床合理的抗生素應用策略，了解細菌耐藥產(chǎn)生機制就顯得尤為重要。隨著人們對細菌耐藥產(chǎn)生機制研究的進展，臨床抗生素的應用策略也在不斷改變，由基于最低抑菌濃度（MIC）的治療策略，發(fā)展為基于耐藥突變選擇窗（mutant selection window， MSW）理論的治療策略。近年來，有學者又提出了與細菌耐藥產(chǎn)生密切相關的亞抑菌濃度（subinhibitory concentration，Sub-MIC）和最小選擇濃度（minimal selective concentration，minSC）概念[3-4]，作為對MSW理論的補充，本文就相關研究進展做一綜述。

1 Sub-MIC

1.1 Sub-MIC和MIC的概念

Sub-MIC指低于MIC而對細菌有選擇作用的抗菌藥物濃度，表明藥物濃度低于MIC時細菌耐藥性仍可增強。Troy將野生型與耐藥突變型大腸埃希菌分別標記，以1∶1的比例混合，置于含不同濃度的環(huán)丙沙星、鏈霉素及四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期進行分類計數(shù)。結果顯示抗菌藥物濃度較低時，野生菌株數(shù)量多于突變菌株；但隨著抗菌藥物濃度增高，突變菌株數(shù)量逐漸增加，原因為突變菌株對環(huán)境的適應性逐漸增加[5]。突變菌株與野生菌株數(shù)量相同時，兩者對環(huán)境適應性相同，此時抗生素濃度被定義為minSC。實驗證實，minSC明顯低于與其對應的MIC，minSC最高為MIC的1/4（抗鏈霉素rpsL105突變），最低僅為1/230（抗環(huán)丙沙星gyrASer83Leu突變）[6]。minSC是細菌產(chǎn)生的突變菌株可擴增的最低藥物濃度，是Sub-MIC對細菌產(chǎn)生影響的閾值。當抗菌藥物濃度低于minSC時，抗菌藥物對細菌無選擇作用；而高于minSC時，抗菌藥物可選擇性擴增耐藥突變菌株。

1.2 Sub-MIC的理論依據(jù)

耐藥突變菌需要在菌群中成為優(yōu)勢菌才能使細菌產(chǎn)生耐藥性，不同環(huán)境中總是適應性強的菌群占據(jù)優(yōu)勢。細菌通過自發(fā)遺傳突變和基因水平轉移產(chǎn)生不同的耐藥亞群（sub-population），不同亞群對環(huán)境有不同的適應性[6]。細菌產(chǎn)生的耐藥突變在提高耐藥性的同時通常會影響細胞正常功能，一般稱之為適應性代價，因此，即使是高耐藥的突變菌，也無法在所有環(huán)境中都占據(jù)優(yōu)勢。如果某種基因型在菌群中所占數(shù)量增加，表明此基因型對環(huán)境適應性強，反之則表明適應性差。需要注意的是，菌群絕對數(shù)量的變化并不能準確反映基因型的適應性，例如菌群數(shù)量不斷減少，而此基因型所占的比例增加，表明這個基因型在此環(huán)境中仍有強適應性[7]（圖1）。傳統(tǒng)MSW理論強調(diào)野生菌株對環(huán)境的適應性，防突變濃度（MPC），為MSW上限，藥物濃度高于MPC時將會同時抑制野生菌株和耐藥菌株生長。MIC定義為MSW下限，此時野生菌株生長速度幾乎為零，突變菌株被選擇性擴增。研究發(fā)現(xiàn)突變菌株在低于MIC時生長速度已經(jīng)高于野生菌株，表明突變菌株在低于MIC環(huán)境中適應性強于野生菌株，MIC不適合作為判定藥物對細菌是否有選擇作用的分界點，應選擇耐藥菌株與野生菌株的生長速度相同時藥物濃度，也就是minSC作為分界點，因為此時耐藥菌株與野生菌株適應性相同。

圖1 環(huán)境適應性

Sub-MIC可增加細菌耐藥突變的頻率。自發(fā)突變是細菌獲得耐藥性的重要途徑，目前人們還無法阻止自發(fā)突變產(chǎn)生，但其發(fā)生率通常為10-6～10-8[8]。因此需要一定基數(shù)的細菌才能產(chǎn)生耐藥突變株。Sub-MIC下，氟喹諾酮類、氨基糖苷類及β內(nèi)酰胺類等藥物可通過啟動細菌SOS系統(tǒng)、增加氧自由基、干擾DNA表達等多種途徑增加細菌自發(fā)突變概率，最高可增至自然狀態(tài)下的15倍[9]。

不同濃度抗生素對細菌會產(chǎn)生不同的選擇作用。Sub-MIC下藥物對細菌的選擇作用需要克服適應性代價才能選擇性擴增耐藥株，因此更容易富集低適應性代價突變，而不是高耐藥性突變菌株。Troy將20株野生型大腸埃希菌分別置于含Sub-MIC抗生素（1/4MIC鏈霉素，1/10MIC環(huán)丙沙星）的培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)并定期測定MIC。20株細菌在400代后對鏈霉素的MIC為實驗開始時的8倍，14株菌600代后MIC增長了16倍。對環(huán)丙沙星的實驗也有類似的結果[5-6]。這些結果證明Sub-MIC環(huán)境下，細菌可產(chǎn)生耐藥突變并選擇性擴增低適應性代價突變菌株，耐藥突變的適應性代價越低，需要產(chǎn)生選擇壓力的抗菌藥物濃度越小，突變株越容易被選擇性擴增?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細菌存在代償性突變機制，細菌通過多次突變，可降低甚至完全消除耐藥突變的適應性代價，使得突變菌在競爭中更有優(yōu)勢[10-11]。Sub-MIC藥物選擇出的低適應性代價突變既可為低耐藥性，也可為高耐藥性。使得細菌可保留多種不同的耐藥突變，為進一步耐藥突變的產(chǎn)生作準備。

與Sub-MIC不同，MSW中抗菌藥物對細菌具有強選擇作用，細菌適應性主要取決于耐藥性強弱，藥物快速清除敏感菌，并選擇性擴增耐藥突變菌，在短時間內(nèi)細菌難以產(chǎn)生高耐藥性突變，因此MSW通常選擇性富集已存在的高耐藥性突變株。

隨著抗菌藥物在醫(yī)學、畜牧、種植業(yè)的大規(guī)模應用，藥物以原形或活性代謝產(chǎn)物形式排放，使得環(huán)境中存在微量濃度的抗菌藥物，極端情況下河水中的環(huán)丙沙星濃度可高達31 mg/L，超過抗感染治療患者的血藥濃度（約2～3 mg/L）[12-13]。自然界中大量致病菌與非致病菌長時間暴露于Sub-MIC環(huán)境中，增加了耐藥突變產(chǎn)生的可能性，使得環(huán)境中細菌成為耐藥基因的潛在來源。

2 Sub-MIC時耐藥產(chǎn)生的機制

Sub-MIC下更容易選擇性富集低適應性代價的耐藥突變株。Gullberg等[14]和Sun等[15]認為改變底物結構、共同抵抗、改變形態(tài)及生物被膜等低適應性代價突變可能為Sub-MIC時耐藥產(chǎn)生的主要機制，而產(chǎn)生外排泵、水解酶等高適應性代價機制的可能性較小。Toprak等[16]通過morbidostat設備動態(tài)調(diào)節(jié)氯霉素、多西環(huán)素和甲氧芐啶3種藥物濃度，保持大腸埃希菌的生長速度衡定為50%最大生長速度。定期測量藥物的50%抑制濃度（IC50），結果發(fā)現(xiàn)3種藥物的IC50均明顯升高。氯霉素和多西環(huán)素IC50上升曲線平滑，結果顯示細菌的mar、acr、cmr等基因存在突變，其中任何一種基因突變均可使IC50增高，產(chǎn)生耐藥性對菌群數(shù)量要求低，IC50曲線較平滑。甲氧芐啶IC50升高曲線呈現(xiàn)明顯階段性。并且發(fā)現(xiàn)幾乎所有耐藥突變均位于DHFR基因，為g-9a或c-35t（DHFR表達增加相關），且突變按一定順序產(chǎn)生。因此需要細菌達到一定數(shù)量才能產(chǎn)生突變，致使IC50曲線呈階段性。以上結果表明Sub-MIC時細菌耐藥產(chǎn)生受細菌與藥物本身種類影響，細菌對不同抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的途徑不同，根本原因為產(chǎn)生的耐藥突變不同。

進一步研究發(fā)現(xiàn)細菌的耐藥性由其耐藥基因決定，Chevereau等[17]在研究大腸埃希菌對Sub- MIC呋喃妥因和氯霉素的IC50時發(fā)現(xiàn)，呋喃妥因的IC50在前10 d快速升高，而后增速明顯降低，基因檢測顯示細菌在呋喃妥因耐藥突變主要位點已產(chǎn)生突變，導致之后僅有少量耐藥突變產(chǎn)生。氯霉素的IC50持續(xù)升高，結果顯示細菌有多個位點可產(chǎn)生耐藥突變，各個突變隨機產(chǎn)生，在基因位點“消耗”完全之前，細菌耐藥性可持續(xù)升高。產(chǎn)生耐藥突變的位點及途徑越多，細菌產(chǎn)生耐藥突變的“儲備”越多，有可能產(chǎn)生更高的耐藥性。見表1。

表1 Sub-MIC產(chǎn)生的耐藥突變

3 Sub-MIC的臨床意義

根據(jù)MSW理論，當藥物濃度達到MPC以上時，敏感菌株及一步耐藥突變菌株的生長菌受到抑制，這時不會有耐藥突變菌株被選擇性富集，從而也不會產(chǎn)生耐藥[18]。但由于藥物在人體內(nèi)分布容積及藥物自身不良反應影響，藥物濃度往往不能達到MPC以上，此時藥物濃度落入MSW中，耐藥菌選擇性富集，菌群產(chǎn)生耐藥，導致治療失敗。藥物濃度下降至MIC以下時，細菌便處于Sub-MIC環(huán)境，藥物從選擇高耐藥性突變變?yōu)檫x擇低耐藥性代價突變（圖2）。此時細菌既可產(chǎn)生新的耐藥突變，也可擴增原有耐藥突變菌，為產(chǎn)生更高耐藥性菌提供基礎。為盡量減少耐藥菌的產(chǎn)生和擴增，學者認為可以通過合理應用抗菌藥物、聯(lián)合用藥、交替用藥等方式減少細菌在Sub-MIC下的暴露時間、減少耐藥突變產(chǎn)生，避免細菌產(chǎn)生耐藥。

圖2 Sub-MIC和MSW

選用在感染部位濃度較高的藥物，提高感染部位的藥物濃度，盡量減少細菌暴露在Sub-MIC及MSW內(nèi)的時間，以及處于Sub-MIC下細菌的數(shù)量。如利奈唑胺較萬古霉素在肺泡上皮襯液及組織液中有較高的濃度[19]，治療肺部感染時可以快速清除細菌，減少暴露于Sub-MIC時間和細菌數(shù)量，從而減少耐藥突變的產(chǎn)生。

由于藥物在體內(nèi)分布濃度不同、高劑量藥物引起的不良反應，以及長期應用抗菌藥物導致菌群MIC/MPC升高，細菌難以避免會處于Sub-MIC環(huán)境。此時應采用聯(lián)合用藥方式，一方面可以縮小或關閉MSW，減少耐藥菌株選擇性富集，另一方面可以減少Sub-MIC下新的耐藥突變的產(chǎn)生[20]。

實際臨床治療過程中，聯(lián)合用藥治療效果可能仍不理想，無法清除細菌、減少耐藥菌產(chǎn)生[21]。原因可能為藥物的相互作用受環(huán)境、細菌種類等多種因素影響，治療過程中細菌的耐藥性改變導致藥物相互作用改變，隨著耐藥性增強，藥物的協(xié)同作用不斷減弱。藥物對細菌的清除能力下降，菌群數(shù)量增加出現(xiàn)更多的耐藥突變，導致治療失敗。

4 不足和展望

目前對Sub-MIC與細菌耐藥的研究對象大多為大腸埃希菌，耐藥產(chǎn)生機制研究主要針對β 內(nèi)酰胺類、酰氨醇類、氨基糖苷類藥物，對當前臨床應用藥物如甘氨酰環(huán)素類、碳青霉烯類藥物缺少相關研究。細菌產(chǎn)生耐藥性基于抗菌藥物種類與細菌自身的基因，不同基因背景可能產(chǎn)生不同的耐藥突變。因此現(xiàn)有研究結果不能很好地預測其他細菌及藥物的耐藥產(chǎn)生機制[22-23]。

細菌除了通過自發(fā)突變的方式產(chǎn)生耐藥基因之外，水平基因轉移也是細菌獲得耐藥性的重要途徑，多重耐藥肺炎克雷伯菌可通過獲得耐藥質(zhì)粒產(chǎn)生對多種抗生素的耐藥性[24]。革蘭陰性菌、革蘭陽性菌多通過水平基因轉移的方式獲得β 內(nèi)酰胺水解酶耐藥基因，從而產(chǎn)生對β 內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性[25]，因此僅根據(jù)Sub-MIC時耐藥產(chǎn)生機制預測β 內(nèi)酰胺類耐藥性并不準確。

Troy認為Sub-MIC下細菌不僅可以產(chǎn)生新的耐藥突變，更重要的是已有的耐藥突變可以選擇性擴增，這與MSW理論中耐藥突變菌僅在MSW內(nèi)富集不同。細菌的自發(fā)性突變總在發(fā)生，菌群中存在一定量的突變菌株，但如果這些突變菌株不被選擇性擴增，成為優(yōu)勢菌，就可以被人體的免疫系統(tǒng)清除[6]。根據(jù)Sub-MIC理論，藥物對耐藥菌株產(chǎn)生選擇性擴增作用的最低濃度是minSC，因此也有人將Sub-MIC看作是MSW理論的補充[26]。Sub-MIC耐藥機制研究發(fā)現(xiàn)不同細菌產(chǎn)生耐藥性的速度、耐藥性強弱各不相同，這是由細菌產(chǎn)生不同的耐藥突變基因決定的。Chevereau等[17]因此認為，Sub-MIC理論可以幫助醫(yī)師在面對感染時，根據(jù)細菌及抗生素種類預測其耐藥性變化，采取更有針對性的治療。

隨著細菌耐藥問題日趨嚴重，Sub-MIC理論研究會更加深入，對動物或人體Sub-MIC的研究比體外研究更具實際應用價值，研究結果能更好地幫助解決細菌耐藥問題。

[1] PALMER AC， KISHONY R. Understanding， predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance [J] .Nat Rev Genet， 2013，14（4）：243-248.

[2] PENA-MILLER R， LAEHNEMANN D，JANSEN G，et al. When the most potent combination of antibiotics selects for the greatest bacterial load： the smile-frown transition [J].PLoS Biol， 2013，11（4）：e1001540.

[3] BOLLENBACH T. Antimicrobial interactions： mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution [J].Curr Opin Microbiol， 2015，27 ：1-9.

[4] CHEVEREAU G， BOLLENBACH T. Systematic discovery of drug interaction mechanisms [J]. Mol Syst Biol， 2015,11（4）：807.

[5] ANDERSSON DI， HUGHES D.Evolution of antibiotic resistance at non-lethal drug concentrations [J]. Drug Resist Updat， 2012，15（3）：162-172.

[6] TROY D， HUIJBEN S，READ AF. Is selection relevant in the evolutionary emergence of drug resistance? [J]. Trends Microbiol， 2015，23（3）：126-133.

[7] BELL G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation [J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 2013，368（1610）：20120080.

[8] SALVERDA ML， DE VISSER JA，BARLOW M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase ： experimental reconstruction and clinical relevance [J]. FEMS Microbiol Rev， 2010 ，34（6）：1015-1036.

[9] CIRZ RT， CHIN JK，ANDES DR，et al. Inhibition of mutation and combating the evolution of antibiotic resistance [J]. PLoS Biol， 2005，3（6）：e176.

[10] ANDERSSON DI， HUGHES D. Gene amplification and adaptive evolution in bacteria [J]. Ann Rev Genet， 2009，43 ：167-195.

[11] ANDERSSON DI， HUGHES D. Persistence of antibiotic resistance in bacterial populations [J]. FEMS Microbiol Rev，2011，35（5）：901-111.

[12] LARSSON DG， DE PEDRO C，PAXEUS N. Effluent from drug manufactures contains extremely high levels of pharmaceuticals [J]. J Hazard Mater， 2007，148（3）：751-755.

[13] TAYLOR NG， VERNER-JEFFREYS DW，BAKER-AUSTIN C. Aquatic systems： maintaining， mixing and mobilising antimicrobial resistance? [J]. Trends Ecol Evol， 2011，26（6）：278-284.

[14] GULLBERG E， CAO S，BERG OG，et al. Selection of resistant bacteria at very low antibiotic concentrations [J].PLoS Pathog， 2011，7（7）：e1002158.

[15] SUN S， BERG OG，ROTH JR，et al. Contribution of gene amplification to evolution of increased antibiotic resistance inSalmonella typhimurium[J]. Genetics， 2009，182（4）：1183-1195.

[16] TOPRAK E， VERES A，MICHEL JB，et al. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection [J]. Nat Genet， 2011，44（1）：101-105.

[17] CHEVEREAU G， DRAVECKá M，MATUR T，et al.Quantifying the determinants of evolutionary dynamics leading to drug resistance [J]. PLoS Biol， 2015，13（11）：e1002299.

[18] DRLICA K. A strategy for fi ghting antibiotic resistance [J]. ASM News，2001，67 ：27-33.

[19] MATSUMOTO K， SHIGEMI A，TAKESHITA A，et al.Analysis of thrombocytopenic effects and population pharmacokinetics of linezolid： a dosage strategy according to the trough concentration target and renal function in adult patients [J]. Int J Antimicrob Agents， 2014，44（3）：242-247.

[20] MEHTA KC， DARGAD RR，BDRADE DM，et al. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases： role of antibiotic combination therapy [J]. J Clin Diagn Res， 2014，8（6）：ME05-8.

[21] SUZUKI S， HORINOUCHI T，F(xiàn)URUSAWA C. Suppression of antibiotic resistance acquisition by combined use of antibiotics[J]. J Biosci Bioeng， 2015，120（4）：467-469.

[22] MUNCK C， GUMPERT HK，WALLIN AI，et al. Prediction of resistance development against drug combinations by collateral responses to component drugs [J]. Sci Transl Med， 2014，6（262）：262ra156.

[23] LáZáR V，PAL SINGH G，SPOHN R，et al. Bacterial evolution of antibiotic hypersensitivity [J]. Mol Syst Biol，2013， 9 ：700.

[24] KIM S， LIEBERMAN TD，KISHONY R. Alternating antibiotic treatments constrain evolutionary paths to multidrug resistance[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2014，111（40）：14494-14499.

[25] DAVIES J， DAVIES D. Origins and evolution of antibiotic resistance [J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2010，74（3）：417-433.

[26] DRLICA K， ZHAO X. Mutant selection window hypothesis updated [J]. Clin Infect Dis，2007，44（5）：681-688.

Sub-inhibitory concentration of antimicrobial agents and its clinical implications

WANG Fangzhou, NI Wentao, CUI Junchang. （Department of Respiratory Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China）

R978.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0597-05

10.16718/j.1009-7708.2017.05.020

2016-12-08

2017-04-06

三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項目（2016YW35），解放軍總醫(yī)院臨床科研扶持基金項目（2014FC-TSYS- 2002）。

中國人民解放軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100853。

王方舟（1993—），男，碩士研究生，主要從事細菌耐藥的預防及抗感染藥物合理應用。

崔俊昌，E-mail：cuijunchang@163.com。