曾鴻俏，張力雄，劉明明，方再光

(海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點實驗室/海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南 ?？?570228)

海洋瓊膠降解菌FG15基因組從頭測序分析

曾鴻俏，張力雄，劉明明，方再光

(海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點實驗室/海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南 海口 570228)

為充分了解瓊膠降解菌FG15的基因功能和代謝途徑，本研究使用SOAP de novo 2.04對Illumina Hiseq2000平臺測序產(chǎn)生的基因片段進行了拼接和組裝，同時利用Glimmer 3.02來預(yù)測基因的開放性閱讀框，并采用蛋白質(zhì)直系同源基因簇(COG)、基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)以及京都基因和基因組百科全書(KEGG)的數(shù)據(jù)來預(yù)測其基因功能，獲得了代謝途徑.結(jié)果表明：FG15的基因組大小為5.10 Mb，G+C含量為44.58%，共有38條Scaffolds,4 922個開放性閱讀框，82個tRNA，2個rRNA； 通過COG分析可將菌株FG15注釋到22種COG功能類型，主要包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；利用GO注釋可將FG15注釋到3大類39個GO功能亞類上；KEGG分析能將其定位到154個代謝通路中，包括物質(zhì)代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成等.次生代謝產(chǎn)物的合成代謝途徑精確顯示，F(xiàn)G15能合成青霉素和頭孢菌素，且其與抗生素抗性實驗的結(jié)果一致.研究結(jié)果為FG15功能基因組學(xué)的研究和相關(guān)次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑以及異源表達的研究提供了理論基礎(chǔ).

瓊膠降解菌；瓊膠寡糖；基因組從頭測序；基因功能；代謝途徑

能夠降解瓊脂的微生物主要來自于海洋，河流、土壤和污水中也有少量分布.海洋中的紅藻，如石花菜(Gelidiumamansii)和江蘺(Gracilaria)等植物的表面通常能分離到瓊膠降解菌(Agarivoranssp.).瓊膠酶是瓊膠降解菌分泌的水解酶，它主要可分為α和β兩類，α-瓊膠酶產(chǎn)生以3,6-內(nèi)醚-α-L半乳糖為還原性末端的瓊寡糖；β-瓊膠酶則產(chǎn)生以β-D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖[1].瓊膠寡糖除了擁有普通寡糖的性質(zhì)以外，它還具有抗癌、抗氧化、抗炎和抗淀粉老化等特性，因而具有極大的開發(fā)潛力[2].

制備瓊膠寡糖的方法主要有化學(xué)法和生物酶法，但由于化學(xué)降解法存在條件不易控制、產(chǎn)物不均一、環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)物分析和回收難等缺點，因而限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用.而使用酶水解法來生產(chǎn)瓊膠寡糖，其消耗的能量較少，反應(yīng)條件亦易于控制，同時該法還具有高效性和專一性，能夠克服化學(xué)降解法中存在的問題[3].因此，將生物催化技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)成為一種公認(rèn)的綠色環(huán)保技術(shù)，且隨著對瓊膠酶的研究越來越深入，用酶水解法來制備瓊膠寡糖已經(jīng)發(fā)展為一種新的方向.

DNA測序經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展：第一代測序技術(shù)是Sanger測序法，第二代測序技術(shù)是高通量測序，第三代測序技術(shù)則是單分子測序.全基因組de novo測序，也稱為基因組從頭測序，屬于第二代測序技術(shù)，它是先在沒有任何參照序列的情況下進行基因組測序，然后再通過生物信息學(xué)拼接和組裝已經(jīng)獲得的序列，進而獲得其基因圖譜.從頭測序有助于充分了解物種的分子進化、基因組成以及基因調(diào)控.

尹群健等[4]從海南島的熱帶海洋環(huán)境中分離和純化出1株革蘭氏陰性瓊膠酶高產(chǎn)菌，并對其進行了分子鑒定及酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明，F(xiàn)G15對氨芐青霉素、羧芐青霉素和頭孢菌素均不敏感；通過16S rDNA序列分析和BLAST同源性比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G15菌株的16S rDNA序列與船蛆桿菌(Teredinibacterturnerae)和噬瓊膠菌(Agarivoranssp.)對應(yīng)序列的同源性最高；FG15與噬瓊膠菌屬的親緣關(guān)系最近；初步鑒定FG15為噬瓊膠菌屬(Agarivoranssp.)； FG15所產(chǎn)的瓊膠酶的最適溫度為36 ℃；最適pH=7.5；產(chǎn)酶主要為胞外酶.本研究通過全基因組從頭測序技術(shù)，分析了海洋瓊膠降解菌FG15的基因組分，并通過與蛋白質(zhì)直系同源基因簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins, COG)、基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology, GO)以及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)的數(shù)據(jù)進行比對，預(yù)測了其基因功能，本研究為通過基因改造來獲得瓊膠寡糖高產(chǎn)菌株和抗生素工程菌提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1菌株以海南陵水熱帶海洋環(huán)境分離和鑒定的瓊膠降解菌(Agarivoranssp.)FG15[4]為實驗對象.

1.2培養(yǎng)基X改良培養(yǎng)基：0.5%的蛋白胨，0.1%的酵母粉，0.1% 的KH2PO4，0.05%的KCl,0.05%的 MgSO4·7H2O，0.7%～2.0%的瓊膠，pH=7.2.

1.3全基因組測序在海南陵水沿海采樣，于無菌條件下將所采集到的樣品研磨，用無菌海水稀釋成梯度菌懸液，分別涂布到X固體培養(yǎng)基上，然后在28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，待平板長出單菌落，挑FG15菌株的單菌落接入X液體培養(yǎng)基中，并于28 ℃和150 r·min-1下?lián)u床過夜培養(yǎng)，在其質(zhì)量濃度大于20 ng·uL-1且為純培養(yǎng)后，提取純基因組DNA，待達到深圳華大基因研究院的送樣標(biāo)準(zhǔn)后，將樣品寄送到華大基因研究院，并由該院進行全基因組的測序.

1.3.1 序列組裝在通過Illumina Hiseq2000平臺測序后，使用SOAP denovo 2.04短序列組裝軟件進行組裝.于reads(高通量測序平臺產(chǎn)生的序列)之間的Overlap區(qū)，通過reads拼接來獲得Contigs，構(gòu)建454 Paired-end庫以確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig的先后順序，然后利用先后順序已知的Contigs來共同組成Scaffold.序列組裝的目的是為了去除接頭、引物及低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并通過優(yōu)化參數(shù)Kmer值來獲得最好的組裝結(jié)果.

1.3.2 基因預(yù)測基因的ORFs是利用Glimmer 3.02軟件來預(yù)測；rRNA是利用RNAmmer 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/)來預(yù)測；tRNA是利用tRNAscan-SE 1.23(http://gtrnadb.ucsc.edu/)來預(yù)測；sRNA(small RibonucleicAcid)小核糖核酸是通過與Rfam10.1數(shù)據(jù)庫進行比對來尋找；串聯(lián)重復(fù)序列則是利用TRF(Tandem Repeat Finder)4.04(http://rfam.sanger.ac.uk/)來預(yù)測；微衛(wèi)星以及小衛(wèi)星序列卻是根據(jù)重復(fù)單元的長度及數(shù)目來進行篩選.

1.3.3 基因組功能注釋通過blastx，將基因序列與NR數(shù)據(jù)庫(Non-redundant GenBank)、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)、SwissProt、蛋白質(zhì)直系同源基因簇(Cluster of Orthologous Groups of Proteins, COG)等的數(shù)據(jù)進行比對，可得到與給定序列具有高度相似性的蛋白，從而得到該基因的蛋白功能注釋信息.根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫(Non-redundant GenBank)的注釋信息，可通過預(yù)測得到基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology, GO) 的注釋信息，再通過網(wǎng)絡(luò)基因本體論注解繪圖工具(Web Gene Ontology Annotation Plot, WEGO)可對其進行詳細(xì)的功能分類，然后根據(jù)蛋白質(zhì)直系同源基因簇(Cluster of Orthologous Groups of Proteins, COG)數(shù)據(jù)庫的注釋信息可預(yù)測其功能分類，最后根據(jù)KEGG注釋信息可進一步得到基因的代謝途徑.

2 結(jié)果與分析

2.1基因組裝結(jié)果分析于軟件SOAPdenovo 2.04測序組裝后，其結(jié)果如表1所示，F(xiàn)G15基因組大小為5 103 kb；共有38個scaffolds，最大長度為1 841 kb，最小長度為506 kb.將所有拼接得到的Contigs按照從大到小的順序排序，其累加片段長度達到所有Contigs總長度的50%時，其所對應(yīng)的Contig長度為N50值；同理，將所有拼接得到的Contigs按照從大到小的順序排序，其累加片段長度達到所有Contigs總長度的90%時，其所對應(yīng)的Contig長度為N90值.N50值和N90值是評價序列組裝好壞的一個指標(biāo)，一般來說，N50值越大，說明組裝得越好，大片段的比例就越高[5].本研究的結(jié)果顯示：N50大小為742 kb，N90則為116 kb.

在基因組注釋中要判斷組裝是否已達到了要求，除了可用一些統(tǒng)計指標(biāo)來表述組裝的完整性和連續(xù)性之外，最重要的就是N50值.但對于基因預(yù)測而言，N50達到基因的平均長度是一個合理的目標(biāo)，它預(yù)示基因中約有50%的基因有望包括在單個scaffold或者Contig中；而對于N90而言，它預(yù)示基因中約有90%的基因有望包括在單個scaffold或者Contig中，這樣會得到一個完整的基因序列[6].

表1 FG15的組裝結(jié)果

2.2基因預(yù)測結(jié)果的分析通過基因預(yù)測、重復(fù)序列預(yù)測、非編碼RNA預(yù)測等方法可獲取測序菌株的基因組組成情況.通過基因組組分的分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G15的基因組大小為5.10 Mb，G+C含量為44.58%，含有4 922個基因，其總長度為4.36 Mb，平均長度為885 bp，占基因組全長的85.35%.對于96個串聯(lián)重復(fù)序列，其總長為22.55 kb，占基因組全長的0.44%，有37個小衛(wèi)星序列，16個微衛(wèi)星序列，82個tRNA，2個rRNA以及13個sRNA.基因預(yù)測結(jié)果的分析表明：FG15具有功能基因組學(xué)研究的理論價值.

基因匹配數(shù)量：A：RNA的加工與修改(1條)；B：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)(1條)；C：能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化(230條)；D：細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂、染色體分配(38條)；E：氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝(353條)；F：核苷酸轉(zhuǎn)運與代謝(81條)；G：糖類運輸與代謝(186條)；H：輔酶轉(zhuǎn)運與代謝(153條)；I：脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝(114條)；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物轉(zhuǎn)化(186條)；K：轉(zhuǎn)錄作用(257條)；L：復(fù)制、重組與修復(fù)(143條)；M：細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/細(xì)胞被膜源(184條)；N：細(xì)胞運動(127條)；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶(147條)；P：無機離子轉(zhuǎn)運與代謝(204條)；Q：次生代謝產(chǎn)物生物合成、運輸與分解代謝(61條)；R：通用功能預(yù)測(388條)；S：未知功能(274條)；T：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制(190條)；U：細(xì)胞內(nèi)運輸、分泌物與膜泡運輸(110條)；V：防衛(wèi)機制(59條)

圖1 FG15的COG功能分類

2.3功能注釋結(jié)果的分析

2.3.1 COG功能分類FG15的COG蛋白的功能注釋信息結(jié)果如圖1，由圖1可知，F(xiàn)G15的功能注釋結(jié)果可分為22類，共有3 487條基因，其中，F(xiàn)G15最多的功能為通用功能(388條)，占11.12%；氨基酸轉(zhuǎn)移與代謝功能(353條)，占10.12%；糖類的運輸與代謝功能(186條)，占5.33%；能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化功能(230條)，占6.59%；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制功能(190條)，占5.45%.在FG15的功能歸類中所占比例較少的有：RNA加工與修改功能(1條)，占0.03%；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)功能(1條)，占0.03%；細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂和染色體分配功能(38條)，占1.09%；核苷酸轉(zhuǎn)運與代謝功能(81條)，占2.32%；次生代謝產(chǎn)物的生物合成、運輸與分解代謝功能(61條)，占1.75%；防衛(wèi)機制功能(59條)，占1.69%.

2.3.2 GO功能注釋GO的功能分類結(jié)果如圖2所示，其主要包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類.GO的功能分類結(jié)果顯示，細(xì)胞過程和代謝過程在生物過程中十分活躍；細(xì)胞和細(xì)胞部位在細(xì)胞過程中占主導(dǎo)地位；整合和催化活性在分子功能中起重要作用；在FG15菌株的基因組中，與生物過程有關(guān)的基因為173 060條，與細(xì)胞組分有關(guān)的基因為3 008條，對應(yīng)到分子功能的基因有3 776條.

圖2 FG15 的GO 功能注釋

2.3.3 KEGG代謝通路KEGG的注釋信息結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，參與FG15的KEGG代謝通路的基因有33類，共有4 101條基因，其中，參與膜運輸代謝途徑的基因最多，共有661條基因，占16.11%；其次為糖代謝，共有428條基因，占10.43%；再次為氨基酸代謝，共有408條基因，占9.94%.

代謝途徑的分析結(jié)果如圖4和圖5所示，結(jié)果表明：基因組涵蓋了糖類代謝、能量代謝、脂類代謝、核苷酸和氨基酸代謝、次生代謝產(chǎn)物的合成代謝等途徑.糖代謝途徑中都包含了糖酵解途徑(見圖4)和磷酸戊糖途徑，此外，本研究還發(fā)現(xiàn)FG15可以利用果糖、甘露糖、半乳糖、淀粉、蔗糖，N-多聚糖，脂多糖等.在次生代謝產(chǎn)物的合成代謝途徑中， FG15能合成青霉素、頭孢菌素(見圖5)、新生霉素、鏈霉素、安沙霉素類和四環(huán)素等.根據(jù)代謝途徑的酶和基因的異同，在此用不同顏色來表示選中的不同代謝途徑及酶基因的差異.

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)G15的基因組大小為5.10 Mb，G+C的含量為44.58%，共有38個scaffolds，1 216個contigs，37個小衛(wèi)星序列，16個微衛(wèi)星序列，82個tRNA，2個rRNA.嗜瓊膠卵鏈菌(Catenovulumagarivorans)YM01T的 G+C含量和白色噬瓊膠菌(Agarivoransalbus)MKT 106的G+C含量分別為44.8%[7]，48%～50%[8]，F(xiàn)G15的G+C含量與之相比比較接近.

在COG的注釋信息中，F(xiàn)G15含有22種COG功能類型，主要包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，其中，共有3406條預(yù)測基因有相應(yīng)的COG功能注釋.在對各功能類別的基因數(shù)目進行統(tǒng)計時發(fā)現(xiàn)，

基因匹配數(shù)量，從上至下依次為：神經(jīng)系統(tǒng)(2)；免疫系統(tǒng)(2)；分泌系統(tǒng)(1)；環(huán)境適應(yīng)性(11)；內(nèi)分泌系統(tǒng)(17)；消化系統(tǒng)(10)；循環(huán)系統(tǒng)(3)；外源性物質(zhì)的降解和代謝(151)；核苷酸代謝(138)；多酮類化合物的代謝(74)；其它氨基酸的代謝(67)；輔酶因子的代謝(164)；脂質(zhì)代謝(173)；多糖生物合成和代謝(92)；酶家族代謝(91)；能量代謝(217)；糖代謝(428)；其它次生物質(zhì)的生物合成和代謝(22)；氨基酸代謝(408)；神經(jīng)變性疾病(18)；新陳代謝疾病(5)；傳染性疾病(53)；免疫系統(tǒng)疾病(3)；癌癥(7)；遺傳信息-翻譯(221)；遺傳信息-轉(zhuǎn)錄(138)；復(fù)制和修復(fù)(288)；折疊，排序和降解(110)；信號分子相互作用(10)；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(223)；膜運輸代謝(661)；細(xì)胞運動(276)；細(xì)胞增殖和消亡(17)；

圖3 FG15的KEGG代謝通路分類圖

其中基因數(shù)目較多的類別主要有通用功能預(yù)測、各種結(jié)構(gòu)的生物轉(zhuǎn)化、復(fù)制、重組和修復(fù)、翻譯、轉(zhuǎn)錄、各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運與代謝、各種機制的發(fā)生等.這與劉君彥等[9]關(guān)于啤酒易感乳桿菌功能基因的研究有很大的相似之處.

本研究中，通過GO注釋可將FG15基因組注釋到3大類39個COG的功能亞類上，與生物過程有關(guān)的基因有173 060條，與細(xì)胞組分有關(guān)的基因有3 008條，對應(yīng)到分子功能的基因有3 776條.在代謝產(chǎn)物合成途徑和比較基因組學(xué)的研究方面，何曉峰等[10]關(guān)于小單孢菌DSM 803全基因組測序及分析的研究在基因數(shù)量、大小等代謝合成途徑上有一定的差異，但是，在主要的基因結(jié)構(gòu)和功能作用方面卻又有相似之處，例如，在功能基因組學(xué)的研究中，研究均發(fā)現(xiàn)其具有很高的GC含量，且COG和GO的基因結(jié)構(gòu)和功能分類都有相似之處，這為后續(xù)的功能基因組學(xué)研究以及生產(chǎn)利用提供了較為堅實的理論基礎(chǔ).在轉(zhuǎn)錄物生物學(xué)過程的功能類型中，細(xì)胞過程和代謝過程占絕大部分，其次是刺激反應(yīng)和生物調(diào)節(jié)過程；而在轉(zhuǎn)錄物細(xì)胞組分的功能類型中，細(xì)胞和細(xì)胞分離所占的比例最高，其次是細(xì)胞器和生物膜，然而蛋白結(jié)合和催化活性卻是轉(zhuǎn)錄物分子功能類型中的主體部分.

KEGG分析能將其定位到154個代謝通路中，包括物質(zhì)代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成等，其中，參與糖代謝的基因有428條，而參與氨基酸代謝的基因有408條.

次級代謝產(chǎn)物是指微生物生長到一定階段后才產(chǎn)生的十分復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該生物無明顯的生理功能或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)[11].FG15次生代謝產(chǎn)物的合成代謝途徑精確顯示，其能合成青霉素和頭孢菌素，并且在菌株的抗生素抗藥性實驗中已證實，F(xiàn)G15對氨芐青霉素、羧芐青霉素和頭孢菌素都不敏感，所得結(jié)果與理論相符.

圖4 FG15 的糖酵解途徑

圖5 FG15 青霉素和頭孢菌素的生物合成通路

目前，在NCBI上公布的白色噬瓊膠菌屬，其一般只被鑒定到屬，并未被鑒定到種，這極大地限制了白色噬瓊膠菌屬的功能基因組學(xué)的研究，究其原因，這可能是其基因組DNA有較高GC含量，從而致使GC高含量區(qū)域的DNA片段未能得到很好地擴增的緣故[12].通過構(gòu)建PCR-free文庫可以在一定程度上消除PCR擴增的偏愛性，但僅依靠一種測序技術(shù)仍然很難獲得基因組的完成圖.可喜的是近年來出現(xiàn)了三代測序技術(shù)，如單分子實時測序儀的出現(xiàn)，它將成為復(fù)雜基因組測序的理想平臺[13]，因為三代測序技術(shù)不再需要進行PCR擴增，并且其讀長可達到20 kb以上，因此，二代和三代測序技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用來共同解析物種全基因組序列將成為主流.

由于測序成本的原因，因此本研究只采用了二代測序技術(shù)來對FG15進行全基因組的從頭測序，但隨著未來測序成本的降低，今后還需通過補充三代測序數(shù)據(jù)，以便將FG15菌株的基因組序列拼接成完成圖.

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Abstract：In order to fully understand gene function and metabolic pathways of FG15, its genome wasdenovosequenced by Illumina Hiseq2000 sequencing system and assembled by SOAPdenovo2.04. Its open reading frames (ORFs), rRNA, and tRNA were predicted by Glimmer 3.02, RNAmmer 1.2, and tRNAscan-SE 1.23, respectively. The function of the genes and the metabolic pathways were annotated by Cluster of Orthologous Groups of proteins (COG), gene ontology (GO), and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). The analysis results from Glimmer 3.02, RNAmmer 1.2, and tRNAscan-SE 1.23 showed that FG15 genome contain 5.10 Mb with a G+C content of 44.58%, a total of 38 scaffolds, 4 922 ORFs, 82 tRNA and 2 rRNA. COG analysis results showed that the genes can be assigned into 22 kinds of COG function, including cell metabolism, cell signal transduction; GO analysis results showed that the genes can be assigned into the 3 major categories, which include 39 GO function class; KEGG analysis results showed that the genes can be assigned into 154 metabolic pathways, including material metabolism, secondary metabolite biosynthesis. The synthesis and metabolism of secondary metabolites analysis results showed that FG15 can synthesize penicillin and cephalosporin, consistent with the results of antibiotic resistance test. Our findings can provide genome sequence information for future functional genomics, biosynthetic pathways and heterologous expression of secondary metabolites of FG15.

Keywords：Agar-degrading bacteria; agar oligosaccharide; genomedenovosequencing; gene function; metabolic pathway

GenomedenovoSequencingofAgar-degradingMarineStrainFG15

Zeng Hongqiao, Zhang Lixiong, Liu Mingming, Fang Zaiguang

(Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Key Laboratory of Biotechnology of Tropical Aquatic Organisms of Hainan Province, Hainan University, Haikou 570228, China)

Q5

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0041

2017-03-20

國家自然科學(xué)基金項目(40666001)；海南大學(xué)青年基金(qnjj1205)；?？h合作項目(02005001)

曾鴻俏(1990-)，男，海南臨高人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2014級在讀碩士研究生，E-mail：zhqcyy@qq.com

方再光(1975-)，男，博士后，副教授，研究方向：海洋微生物功能基因及熱帶大型藻類培養(yǎng)技術(shù)的研究工作，E-mail：guangyan0508@163.com

1004-1729(2017)03-0260-08