雷宇苗，朱曉鵬，凌小惠 ，張 璐， 長(zhǎng)孫東亭， 羅素蘭

(1.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228；2. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228)

α3 nAChRs亞基基因中定點(diǎn)氨基酸的突變研究

雷宇苗1,2，朱曉鵬1,2，凌小惠1，張 璐1,2， 長(zhǎng)孫東亭1,2， 羅素蘭1,2

(1.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228；2. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 海口 570228)

為了利用重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)α3亞基中指定的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，以便為今后深入研究煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)中關(guān)鍵氨基酸的功能及與藥物作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，本研究以α3 nAChRs亞基基因作為模板，利用重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)α3亞基中指定的氨基酸進(jìn)行了定點(diǎn)突變，突變后的基因片段被連接到pMDTM18-T載體上，并通過(guò)基因測(cè)序來(lái)驗(yàn)證突變的正確性.結(jié)果表明：通過(guò)重疊延伸PCR法已將α3 nAChR N端第174位的丙氨酸(Alanine，Ala，A)成功突變?yōu)楣劝彼?Glutamic acid，Glu，E).由此認(rèn)為：重疊延伸PCR法成功實(shí)現(xiàn)了α3 nAChRs亞基基因中定點(diǎn)氨基酸的突變，該方法可為更多受體突變型的建立提供借鑒，也可為研究nAChRs中關(guān)鍵氨基酸的功能以及藥物與nAChRs相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).

煙堿型乙酰膽堿受體； 定點(diǎn)突變； 重疊延伸PCR

近年來(lái),隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，定點(diǎn)突變技術(shù)逐漸成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間相互作用關(guān)系的重要工具[1].尤其是在研究受體和通道蛋白結(jié)構(gòu)及其功能方面，定點(diǎn)突變技術(shù)在確定受體和通道蛋白中關(guān)鍵氨基酸的作用、通道開(kāi)放調(diào)控的分子機(jī)制以及藥物與受體相互作用的分子機(jī)理等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2].重疊延伸PCR法是目前常用的一種定點(diǎn)突變技術(shù)，該方法主要采用一對(duì)互補(bǔ)配對(duì)的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，然后在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸來(lái)實(shí)現(xiàn)片段的重疊連接[3-4](見(jiàn)圖1)，并在互補(bǔ)引物中設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)目的片段的突變.該技術(shù)不受突變位置及突變類型的限制，可以在DNA的任何位置引入突變，還可以通過(guò)設(shè)計(jì)兩側(cè)引物和添加酶切位點(diǎn)來(lái)進(jìn)一步地克隆連接[5].重疊延伸PCR法的成功率很高，且價(jià)格低廉，因而其運(yùn)用廣泛.

nAChRs是一種具有重要生理功能的配體門控離子通道，它可以釋放多巴胺、去甲腎上腺素、五羥色胺、γ-氨基丁酸等多種神經(jīng)遞質(zhì)，具有介導(dǎo)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能，是一種普遍存在于動(dòng)物界中的具有重要生理作用和臨床研究意義的膜蛋白[6].nAChRs可由α亞基或者β亞基單獨(dú)或者共同組合而形成不同的nAChRs亞型，不同的亞型具有不同的生理功能，其也與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如α3β2或α3β4 nAChR與疼痛、癌癥和重癥肌無(wú)力等有關(guān)[7]，α6* nAChRs與成癮和記憶損傷有關(guān)[8-9]，α7 nAChRs與急性肺損傷、老年癡呆癥等疾病有關(guān)[10]，α9α10 nAChRs與小細(xì)胞癌癥和慢性疼痛有關(guān)[11].由于這些不同亞型的結(jié)構(gòu)都非常相似，許多配體極難區(qū)分，因此這也給各種亞型的生理學(xué)和藥理學(xué)功能的研究帶來(lái)了極大的困難.

α3亞基可參與調(diào)節(jié)機(jī)體器官的平衡，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用[12].它主要參與α3β2 nAChRs和α3β4 nAChRs兩種亞型的組成，這兩種亞型主要分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，可參與人體許多生理和病理過(guò)程，如癌癥，疼痛等；因此，α3* nAChRs也是治療相關(guān)疾病的潛在藥物靶點(diǎn).盡管如此，然而目前有關(guān)α3亞基參與調(diào)控機(jī)體的病理機(jī)制仍不清楚，因此，構(gòu)建α3亞基的點(diǎn)突變型，并利用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)研究α3 nAChRs亞基中關(guān)鍵氨基酸的作用，不僅有助于研究α3 nAChRs亞基結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系，而且也有助于研究藥物與α3 nAChRs相互作用的分子機(jī)制.鑒此，本實(shí)驗(yàn)以α3 nAChRs亞基基因作為模版，設(shè)計(jì)了一對(duì)互補(bǔ)引物(包括突變位點(diǎn))和一對(duì)側(cè)翼引物，同時(shí)采用重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)α3 nAChRs N端配體結(jié)合區(qū)域的第174位氨基酸進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并將突變基因片段克隆到pMDTM18-T載體上，然后將其轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌細(xì)胞中，最后于提取質(zhì)粒后通過(guò)基因測(cè)序來(lái)確認(rèn)其突變結(jié)果的正確性.

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料α3 nAChRs基因、大腸桿菌(E.coli)DH5α均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.1.2 試 劑質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司；DNA Marker DL10000、PrimeSTAR·HS DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、pMDTM18-T、DpnI酶、氨芐青霉素等購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；GoldViewⅡ型核酸染色劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司.

1.1.3 儀 器PCR儀(ABI 2720)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Nanodrop)、小型水平電泳儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(Alphalmager MiNi)等.

1.2方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)重疊延伸PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)的原理，采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了4條引物，該引物將α3亞基基因N端(配體結(jié)合區(qū))第174位密碼子為GCU的Ala突變成密碼子為GAG的Glu(見(jiàn)表1).由表1可知，F(xiàn)和R為側(cè)翼引物，用于擴(kuò)增基因全長(zhǎng)；Rm和Fm則為兩條完全互補(bǔ)的引物，且已經(jīng)引入了突變位點(diǎn)(字體加粗的為突變位點(diǎn))，它們分別與側(cè)翼引物F和R搭配來(lái)擴(kuò)增突變基因及其兩側(cè)的基因片段.

表1 引物列表

1.2.2 目的基因的突變重疊延伸PCR法是通過(guò)3輪PCR反應(yīng)來(lái)完成的(原理如圖1所示)，即使用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒來(lái)提取α3 nAChRs的質(zhì)粒，并以其為模板，分別以Fm和R以及Rm和F為引物，進(jìn)行兩次獨(dú)立的PCR以擴(kuò)增受體基因片段.具體而言就是先以基礎(chǔ)質(zhì)粒作為模板，用正向側(cè)翼引物F和突變引物Rm進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，并使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，所得產(chǎn)物是包含突變位點(diǎn)的上游片段；然后也以基礎(chǔ)質(zhì)粒為模板，用反向側(cè)翼引物R和突變引物Fm進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，也使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，所得產(chǎn)物為包含突變位點(diǎn)的下游片段；第三步則是將第一輪PCR和第二輪PCR的產(chǎn)物同時(shí)作為模版，用正/反向側(cè)翼引物F和R進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增，并使用Taq酶，所得產(chǎn)物即為引入了目的突變的全長(zhǎng)基因片段.以上PCR的條件均為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)；末次循環(huán)后，72 ℃再延伸5min.第一輪PCR和第二輪PCR的反應(yīng)體系為50 μL，包括：5×Buffer 10 μL、dNTP 4 μL、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 2 μL、引物(150～200 ng)，質(zhì)粒模板(100～150 ng)、補(bǔ)充到體系50 μL所需的ddH2O；第三輪PCR的反應(yīng)體系為25 μL，包括：第一輪PCR和第二輪PCR產(chǎn)物各3 μL、5×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、補(bǔ)充到體系25 μL所需的ddH2O 25 μL.

圖1 重疊延伸PCR 原理圖

注：第一輪PCR和第二輪PCR使用的都是高保真酶，第三輪PCR使用的則是Taq 酶，并提供polyA尾巴，以便連接T載體.

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆在進(jìn)行第三輪PCR前，在第一輪和第二輪PCR產(chǎn)物里分別加入1 μL DpnI酶，并在37 ℃水浴2 h以酶解模版質(zhì)粒(DpnI不酶解PCR延伸產(chǎn)物，這是由于原來(lái)的質(zhì)粒模版來(lái)源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)Dam甲基化修飾的，它因?qū)pnI敏感而被切碎；而在體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒，由于其沒(méi)有甲基化而不被切開(kāi))；然后將第三輪PCR產(chǎn)物在T4連接酶的作用下與克隆載體pMDTM18-T連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，接著取50 μL搖床培養(yǎng)1 h的菌液，將其涂布于含氨芐青霉素的LB平板中，并于37 ℃培養(yǎng)16 h；最后挑取單個(gè)菌落，在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)13 h.

1.2.4 PCR結(jié)果測(cè)序驗(yàn)證用質(zhì)粒小提試劑盒提取上述克隆質(zhì)粒，將提取的重組質(zhì)粒送到生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行目的片段序列的測(cè)序，并利用NCBI里的Blast將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì).

2 結(jié)果與分析

2.1各段PCR結(jié)果的驗(yàn)證以α3 nAChR的質(zhì)粒為基礎(chǔ)質(zhì)粒模板，用正向側(cè)翼引物F和突變引物Rm進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物是包含突變位點(diǎn)的上游片段，其結(jié)果是以w=0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證(見(jiàn)圖2).圖2A中M孔道為DL 10 000的DNA Maker，第1孔道為第一輪PCR產(chǎn)物，第2孔道為第二輪PCR產(chǎn)物，從從圖2A中可以看出，在目的條帶區(qū)域有符合條件的特異性擴(kuò)增條帶，條帶大小約為1 000 bp，但條帶不是特別清晰，這可能是由于擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度較低的緣故；接著，也以基礎(chǔ)質(zhì)粒為模板，用反向側(cè)翼引物R和突變引物Fm進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，所得產(chǎn)物為包含突變位點(diǎn)的下游片段，其結(jié)果也以w=0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證(見(jiàn)圖2)，從結(jié)果可知，在目的條帶區(qū)域有符合條件的特異性擴(kuò)增條帶，條帶大小約為1 000 bp，且條帶清晰.在第一輪PCR和第二輪PCR的產(chǎn)物里分別加入1 μL的DpnI酶，并于37 ℃水浴2 h以酶切質(zhì)粒模版，這是為了避免在隨后的轉(zhuǎn)化過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性，隨后再將第一輪PCR和第二輪PCR的產(chǎn)物同時(shí)作為模版，用正/反向側(cè)翼引物F和R進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物即為含α3 nAChRs的全長(zhǎng)基因片段，其結(jié)果以w=0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證(見(jiàn)圖2).圖2B中M孔道為DL 10 000的DNA Maker，第1孔道為α3 nAChRs質(zhì)粒，其大小約為4 500 bp；第2孔道為第三輪PCR產(chǎn)物，其大小約為2 000 bp，從圖2B中可以看出，第三輪PCR成功地將第一輪PCR產(chǎn)物和第二輪PCR產(chǎn)物連接在一起，實(shí)現(xiàn)了片段的重疊延伸.

2.2克隆結(jié)果分析將第三輪PCR產(chǎn)物在T4連接酶的作用下與大小為2 692 bp的克隆載體pMDTM18-T(具有Amp+抗性)連接后，可以獲得大小約為4 700 bp的片段，當(dāng)以w=0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證時(shí)，其結(jié)果見(jiàn)圖2.在圖2C中，在2 000 bp處有未連接成功的清晰條帶，在4 700 bp處也有目的條帶，但不是特別清晰，這可能是由于載體模版量比較少，從而導(dǎo)致連接產(chǎn)物較少的緣故.當(dāng)樣品被轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌細(xì)胞中時(shí)，在含抗性的LB平板中可長(zhǎng)出菌落(如圖3)，從圖3可看出，菌落長(zhǎng)得比較密集，這證明重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率較高，這可能是由于在第三輪PCR前，已加入了DpnI 酶，其酶解了原來(lái)的質(zhì)粒模版，減小了克隆結(jié)果可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性的緣故.在用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒后，取2 μL質(zhì)粒，并以w=0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證其結(jié)果(如圖2D)，從圖2D中可以看出，重組質(zhì)粒的條帶清晰，其大小符合目的片段，這證明克隆載體成功連接.將所提取的重組質(zhì)粒送到生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行目的片段的序列測(cè)定，并利用NCBI里的Blast對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，通過(guò)比對(duì)可知，已將目的基因GCT變成了GAG(見(jiàn)圖4).

圖2 PCR 結(jié)果圖

A：圖A為第一輪和第二輪PCR的結(jié)果圖，孔道1第一輪PCR產(chǎn)物，孔道2為第一輪PCR產(chǎn)物(孔道2)；B:圖B為第三輪PCR的結(jié)果圖，孔道1為α3 nAChR質(zhì)粒，孔道2為第三輪PCR的產(chǎn)物；C:圖C為PCR產(chǎn)物的克隆連接圖，孔道1為連接片段；D：圖D為重組質(zhì)粒的瓊脂糖電泳圖，孔道1為重組質(zhì)粒；A—D中的M 孔道為DL 10 000的DNA Maker.

圖3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

圖4 序列對(duì)比圖

3 總 結(jié)

nAChRs廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，近年來(lái)已成為科研人員爭(zhēng)相研究的熱點(diǎn).但目前nAChRs結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系還未可知，這也成為研究nAChRs的一大阻礙.而定點(diǎn)突變技術(shù)可以通過(guò)氨基酸的替換來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的相互作用關(guān)系，已經(jīng)成為一種的重要研究工具.

α3亞基廣泛分布于皮層及丘腦各核團(tuán)中，可參與調(diào)節(jié)機(jī)體許多重要的生理進(jìn)程.研究證明，敲除α3基因的小鼠與正常小鼠相比會(huì)出現(xiàn)體重下降、生長(zhǎng)速度緩慢、智力發(fā)育低下、視力發(fā)育低下、泌尿功能系統(tǒng)受損等現(xiàn)象[12].α3亞基一般可以與β2或β4亞基結(jié)合，形成有功能的α3β2或α3β4 nAChR亞型.α3β2 nAChRs已被鑒定為是一種治療機(jī)械性疼痛的分子靶標(biāo)，α3β4 nAChRs也被報(bào)道可參與到小細(xì)胞肺癌的治療[13-14].由此可見(jiàn)α3亞基不僅在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，還是許多疾病的潛在作用靶點(diǎn)，但目前α3亞基參與調(diào)控機(jī)體的病理機(jī)制還未清楚，為此，利用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)來(lái)構(gòu)建α3亞基的點(diǎn)突變型，對(duì)研究α3 nAChRs亞基中關(guān)鍵氨基酸的作用，揭示α3 nAChRs亞基結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為研究藥物與α3 nAChRs相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).該研究以α3 nAChR亞基基因?yàn)槟０?，采用重疊延伸PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了目的基因的突變，這也為日后更多突變體的構(gòu)建提供方法.同時(shí)也證實(shí)了重疊延伸PCR技術(shù)是一種高效、經(jīng)濟(jì)的DNA突變方法.重疊延伸PCR在設(shè)計(jì)互補(bǔ)引物時(shí)，至少需要有10 bp完全匹配，也可以根據(jù)需要使之完全互補(bǔ)配對(duì).在設(shè)計(jì)兩端的側(cè)翼引物時(shí)可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，以便于進(jìn)一步的連接克隆.第一輪和第二輪PCR產(chǎn)物之間通過(guò)形成的重疊鏈可在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸將片段拼接起來(lái).第一輪和第二輪PCR使用高保真聚合酶可減少堿基之間的錯(cuò)配機(jī)率，提高突變的正確率，且第一輪和第二輪PCR產(chǎn)物分別加入DpnI酶，酶切質(zhì)粒模版，可避免出現(xiàn)假陽(yáng)性，保證突變的正確性.第三輪PCR使用Taq酶可使PCR產(chǎn)物產(chǎn)生polyA尾巴，便于和T載連接，做進(jìn)一步研究.

綜上結(jié)果證明重疊延伸法介導(dǎo)α3 nAChR基因的定點(diǎn)突變方法構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)室建立了一種對(duì)α3 nAChRs結(jié)構(gòu)和功能的研究方法，這對(duì)日后更多突變體的構(gòu)建起到了指導(dǎo)作用，為深入研究受體配體間的關(guān)系以及指導(dǎo)藥物的改造奠定基礎(chǔ).

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Abstract：In order to lay a foundation for the further functional study of the key amino acids of α3 nAChR, in the study, α3 nAChRs subunit gene was usd as the template, and overlap extension PCR technique was used for point mutation of α3 nAChRs. Then, the mutant was cloned into pMDTM18-T for sequencing. The sequencing results indicated that α3 nAChR’s 174th Ala is mutated to Glu successfully.

Keywords：nAChRs; site-directed mutagenesis; overlap extention PCR

Site-directedMutagenesisofα3nAChRsSubunit

Lei Yumiao1，2, Zhu Xiaopeng1，2, Ling Xiaohui1, Zhang Lu1，2, Zhangsun Dongting1，2, Luo Sulan1，2

(1. Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Key Laboratory for Marine Drug of Haikou, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. The Ocean College, Hainan University, Haikou 570228, China)

R93

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0042

2017-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(81420108028)；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT_15R15)；海南省普通高等學(xué)校研究生創(chuàng)新科研課題(Hys 2016-15)；海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究資助項(xiàng)目(Hnky2017-16)

雷宇苗(1993-)，女，漢族，碩士研究生 研究方向：海洋藥物 E-mail:m18889277924@163.com

羅素蘭，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師 研究方向：海洋藥物 Tel: (0898)66289538 E-mail:luosulan2003@163.com

1004-1729(2017)03-0268-05