沈金花，譚鴻浩，雷 駿

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所,武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

箬竹葉氯仿部提取物對(duì)小鼠氣管平滑肌的舒張作用及其機(jī)理

沈金花，譚鴻浩，雷 駿

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所,武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

使用高鉀溶液(80 mmol/L KCl)和乙酰膽堿(100 μmol/L ACh)對(duì)小鼠離體氣管環(huán)進(jìn)行了預(yù)處理誘導(dǎo)氣道異常收縮，進(jìn)而研究了箬竹葉氯仿部提取物(CEIT)對(duì)氣管的舒張作用及其機(jī)理.結(jié)果表明：CEIT能夠抑制高鉀和ACh誘導(dǎo)的預(yù)收縮，且呈劑量依賴性. 此外，CEIT阻斷了VDCCs電流，抑制了細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流. 在ACh誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)中，不僅VDCCs通道參與其中，還有其他離子通道的參與. CEIT能夠抑制NSCCs通道，從而抑制內(nèi)鈣釋放.CEIT能夠通過阻斷VDCCs通道和NSCCs通道抑制外鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，從而舒張小鼠氣管平滑肌.提示CEIT中的活性成分可以作為一種治療氣道異常收縮的藥物.

箬竹葉氯仿部提取物；氣管平滑肌；電壓依賴型鈣離子通道；非選擇性陽(yáng)離子通道

AbstractTo investigate whether chloroform extracts from leaves ofIndocalamustessellatus(CEIT) could relax precontracted airway smooth muscle and its mechanism, 80 mmol/L KCl and 100 μmol/LACH were used to induce abnormal contraction of airway smooth muscle. Results: The precontracted mouse ASM could be relaxed by CEIT in a concentration-dependent manner. Besides, CEIT could block VDCCs to restrain Ca2+influx. In the precontraction induced by ACh, there might be other channels involved except VDCCs.CEIT could block NSCCs to restrain the release of intracellular calcium. Conclusions: CEIT can relax the precontracted airway smooth muscle by blocking the VDCCs and NSCCs, which suppressed the cytoplasm Ca2+increase. These data suggested that CEIT might be potential drugs for the treatment of abnormal airway smooth muscle contraction.

KeywordsChloroform extracts from leaves ofIndocalamustessellatus;airway smooth muscle;voltage-dependent calcium channel; non-selective cation channel

哮喘是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病之一，其主要特征為氣道平滑肌收縮性增強(qiáng)、氣道高反應(yīng)以及氣道重塑[1].當(dāng)哮喘發(fā)作時(shí)，氣道會(huì)異常收縮，導(dǎo)致氣道狹窄，引起呼吸不適，威脅人類生命安全[2, 3].緩解哮喘發(fā)作癥狀，常常要吸入β2腎上腺素激動(dòng)劑[4]，但是由于副作用較大，長(zhǎng)期使用會(huì)影響心血管功能. 亟待尋找一種有效且毒副作用小的藥物，用于治療氣道的異常收縮.

箬竹(Indocalamustessellatus)是禾本科竹亞科箬竹屬植物. 箬竹葉中所含化學(xué)成分主要為黃酮、茶多酚和可溶性糖類[5].目前，還尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道箬竹葉或箬竹葉活性成分用于氣管平滑肌上的研究.本文擬提取箬竹葉氯仿部提取物，檢測(cè)其中是否有活性物質(zhì)可以舒張異常收縮的氣管平滑肌.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑和儀器

箬竹葉(采于湖北利川縣)，經(jīng)中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉虹副教授鑒定為箬竹(Indocalamustessellatus)的葉子.

高鈣溶液(2 Ca2+PSS)：NaCl 135 mmol/L、KCl 5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L，調(diào)pH值至7.42.無(wú)鈣溶液(0 Ca2+PSS)：NaCl 135 mmol/L、KCl 5 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L，NaOH調(diào)pH值至7.42.Ca2+母液：CaCl2120 mmol/L.高鉀溶液：KCl 4 mol/L.ACh：100 mmol/L.rTASM解離液：NaCl 120 mmol/L、KCl 5.2 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO40.6 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、D-glucose 11 mmol/L、HEPES 10 mmol/L,調(diào)pH值至7.40.細(xì)胞外液：NaCl 105 mmol/L、CsCl 6 mmol/L、BaCl227.5 mmol/L、Glucose 11 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、TEA-Cl 10 mmol/L，調(diào)pH值至7.40.電極內(nèi)液：CsCl 130 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、MgCl24 mmol/L、MgATP 4 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，調(diào)pH值至7.20.

酶溶液I：木瓜蛋白酶 3 mg/mL，DTT 0.15 mg/ mL，BSA 1 mg/mL；酶溶液II：膠原蛋白酶H 1 mg/mL，BSA 1 mg/mL.

離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(HV-4，成都泰盟科技有限公司)，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420S，成都泰盟科技有限公司)，張力換能器(JH-2，航天醫(yī)學(xué)工程研究所)，膜片鉗放大器(HEKA，EPC-10，德國(guó)Lambrecht)，玻璃微電極(外徑1.4 mm，南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)，中草藥粉碎機(jī)(天津市秦斯特儀器有限公司).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性BALB/C小鼠，SPF級(jí)，平均年齡6～8周，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心.在控溫、控濕的條件下，自由飲水進(jìn)食.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和處理均遵照《中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與福利指導(dǎo)手冊(cè)》.

1.2箬竹葉氯仿部提取物的制備

新鮮葉片曬干，粉碎成粉末.稱取250 g室溫下浸泡于85%的乙醇溶液5000 mL中.浸泡液加熱至85 ℃，回流3 h，過濾取上清液，重復(fù)上述步驟，直至將所有的浸泡液提取完.合并上清液,減壓蒸干，得到乙醇浸膏.

將乙醇浸膏用1000 mL超純水溶解完全，加石油醚萃取，每次300 mL，總共3次，棄掉石油醚部，留下水部加入氯仿萃取3次，每次300 mL.合并氯仿部溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，獲得箬竹葉氯仿部提取物.真空干燥，干重約為原材料的0.32 %.將箬竹葉氯仿部提取物(Chloroform extracts from leaves ofIndocalamustessellatus，CEIT)溶解于10% DMSO中，調(diào)pH值至7.40.

1.3小鼠離體氣管環(huán)的處理與上樣

斷頸法處死小鼠.取出主氣管及肺組織，于預(yù)冷的PSS溶液中去除食管，結(jié)締組織和脂肪組織，最后靠近氣管三角區(qū)取5 mm左右的氣管.將氣管環(huán)掛到張力換能系統(tǒng)上，置于含有6 mL PSS液并持續(xù)通氧的水溫37 ℃的恒溫水浴槽內(nèi).氣管環(huán)前負(fù)荷設(shè)置為300 mg，每15 min更換一次PSS溶液，連續(xù)4次.平衡60 min后，用80 mmol/L KCl或100 μmol/L ACh預(yù)刺激3次，使氣管環(huán)處于最佳收縮狀態(tài)，洗脫后恢復(fù)至基線，讓組織休息30 min后開始實(shí)驗(yàn)[6, 7].

1.4小鼠氣管平滑肌細(xì)胞的制備

頸部脫臼處死小鼠后，迅速取出小鼠氣管，置于含rTASM解離液的解剖皿中，分離出主氣管及支氣管后，沿肌條與軟骨環(huán)的連接處剪開，去除軟骨組織.將呈“Y”型的肌條放入35 ℃預(yù)熱10 min的酶Ⅰ中消化22 min，然后轉(zhuǎn)入35 ℃預(yù)熱10 min的酶Ⅱ中消化8 min,用BSA清洗2次，轉(zhuǎn)入含300 μL BSA的EPP管，打散后置于冰上備用[7, 8].

1.5全細(xì)胞電流記錄

通過EPC-10膜片鉗放大器檢測(cè)全細(xì)胞VDCC電流.鉗制電壓為-70 mV，維持50 ms，給予細(xì)胞去極化階刺激1000 ms，刺激電壓從-70 mV逐漸增加至+40 mV，每10 s增加10 mV，拾取步階脈沖電流信號(hào).

使用EPC-10膜片鉗放大器測(cè)得NSCCs電流.采用全細(xì)胞記錄方式來(lái)記錄乙酰膽堿誘導(dǎo)的NSCCs電流.溶液中游離的Ca2+濃度約為70 nmol/L，通過WEBMAX計(jì)算符合標(biāo)準(zhǔn).溶液中預(yù)先加入了硝苯地平(Nifedipine)，尼氟酸(Niflumic acid)和四乙胺(TEA)，用來(lái)排除VDCCs電流、K+電流和Cl-電流的影響.細(xì)胞鉗制電壓為-60 mV，在ramp條件下，從-80 mV到+60 mV用時(shí)500 ms.

數(shù)據(jù)用Patchmaster軟件導(dǎo)出，Origin8分析作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 CEIT對(duì)高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管平滑肌的舒張作用

CEIT可以劑量依賴性地抑制高K+誘導(dǎo)的氣管收縮，收縮被抑制一半時(shí)的濃度(IC 50)為1.99 mg/mL，最大舒張值為98.61±3.62%.硝苯地平是一種VDCCs的選擇性阻斷劑，10 μmol/L硝苯地平可以完全阻斷80 mmol/L的高K+誘導(dǎo)的氣管收縮.CEIT抑制氣管收縮的同時(shí)對(duì)靜止張力無(wú)影響.

2.2 CEIT抑制高K+引起的Ca2+內(nèi)流

細(xì)胞外無(wú)Ca2+時(shí)，高K+無(wú)法引起氣管環(huán)收縮，當(dāng)胞外存在Ca2+時(shí)，能引起氣管環(huán)收縮，3 mg/mL CEIT可抑制此收縮.當(dāng)用3 mg/mL CEIT孵育氣管時(shí)，高K+引起的收縮并沒有被觀察到(圖1).故CEIT舒張高K+誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管平滑肌是通過抑制VDCCs介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流引起的.

圖1 CEIT抑制高K+引起的Ca2+內(nèi)流Fig.1 CEIT blocks high K+-evoked Ca2+ influx

2.3 CEIT阻斷VDCCs電流

在沒有硝苯地平或者CEIT存在的情況下，單個(gè)氣管平滑肌細(xì)胞在不同電壓梯度刺激下的VDCCs電流(Ba2+作為載體電荷)，電流呈先增大后減小趨勢(shì)；當(dāng)加入10 μmol/L硝苯地平或者3 mg/mL CEIT后，電流被抑制(圖2).提示CEIT可能與硝苯地平作用類似，CEIT能夠阻斷VDCCs的電流.

圖2 CEIT阻斷VDCCs電流Fig.2 CEIT blocks VDCCs currents

2.4 CEIT對(duì)ACh誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管平滑肌的舒張作用

乙酰膽堿(ACh)可以激活電壓依賴型鈣離子通道(VDCCs)和非選擇性陽(yáng)離子通道(NSCCs)，調(diào)控細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入胞質(zhì)中和肌漿網(wǎng)中Ca2+釋放到胞質(zhì)中，使得胞質(zhì)中Ca2+濃度增加[9].CEIT呈劑量依賴性地抑制ACh誘導(dǎo)的氣管收縮，收縮被抑制一半時(shí)的濃度(IC50)為2.13 mg/mL，最大舒張值為97.51 %±3.97%(圖3).

圖3 CEIT舒張ACh誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管平滑肌Fig.3 CEIT inhibits ACh-induced precontraction

用硝苯地平抑制VDCCs通道，使胞質(zhì)中Ca2+濃度有所下降，因此出現(xiàn)部分舒張(23.26%±2.17%)，再加入4 mg/mL CEIT后，基本能完全舒張氣管(97.57%±2.86%)(圖4 A).當(dāng)硝苯地平存在的條件下，ACh仍然能引起氣管環(huán)的收縮，說明ACh能激活其他通道使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，這種收縮能被CEIT抑制，舒張百分比達(dá)到95.07%±6.48%(圖4 B).故CEIT還抑制其他的通道參與氣管環(huán)的舒張.

圖4 排除VDCCs通道后，CEIT仍能舒張氣管平滑肌Fig.4 CEIT can also relax precontracted airway smooth muscle even without VDCCs

2.5 CEIT抑制ACh引起的內(nèi)鈣釋放

在零鈣條件下，加入ACh，由于細(xì)胞外無(wú)Ca2+進(jìn)入，但會(huì)引起肌漿網(wǎng)中Ca2+的瞬時(shí)釋放，引起一個(gè)瞬時(shí)的收縮(圖5).當(dāng)細(xì)胞外Ca2+濃度恢復(fù)后，胞外Ca2+和肌漿網(wǎng)中Ca2+共同作用使胞質(zhì)中Ca2+濃度增加，因而氣管會(huì)出現(xiàn)一個(gè)持續(xù)而穩(wěn)定的收縮，而該收縮能被4 mg/mL CEIT抑制，最大舒張達(dá)到91.15%±10.49%.

圖5 CEIT抑制ACh引起的內(nèi)鈣釋放Fig.5 CEIT inhibits release of intracellular calcium induced by ACh.

2.6 CEIT抑制NSCCs電流

用膜片鉗技術(shù)測(cè)量單個(gè)氣管平滑肌細(xì)胞的NSCCs電流.預(yù)先加入硝苯地平、尼氟酸和四乙胺以排除VDCCs電流、K+電流、Cl-電流的影響.在-80 mV～ +60 mV的ramp條件下記錄ACh引起的NSCCs電流(圖6)，發(fā)現(xiàn)在-70 mV的條件下，4 mg/mL CEIT可以阻斷NSCCs電流.

圖6 CEIT抑制NSCCs電流Fig.6 CEIT blocks NSCCs currents

3 結(jié)語(yǔ)

箬竹葉氯仿部提取物能引起預(yù)收縮的小鼠氣管平滑肌舒張是通過阻斷VDCCs通道和NSCCs通道使胞質(zhì)中Ca2+濃度下降來(lái)實(shí)現(xiàn)的.首先，用激動(dòng)劑高K+模擬哮喘患者發(fā)病時(shí)異常收縮的氣管，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CEIT可以完全舒張預(yù)收縮的氣管.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CEIT是通過抑制Ca2+內(nèi)流來(lái)舒張氣管平滑肌.單細(xì)胞離子通道驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CEIT可以完全阻斷VDCCs電流.ACh可以同時(shí)激活VDCCs和NSCCs兩種離子通道，綜合作用使得細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，使氣管平滑肌收縮.研究發(fā)現(xiàn)CEIT可以完全舒張由ACh預(yù)收縮的氣管平滑肌.用VDCCs通道的特異性阻斷劑硝苯地平來(lái)排除VDCCs通道的影響，發(fā)現(xiàn)CEIT仍然能舒張余下部分的收縮.此外，CEIT可以阻斷NSCCs電流.綜上所述，CEIT可以阻斷VDCCs通道和NSCCs通道來(lái)舒張預(yù)收縮的氣管平滑肌.因此，箬竹葉中的活性成分將來(lái)有望作為一種潛在的氣管擴(kuò)張劑用于治療氣道異常收縮相關(guān)疾病.

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RelaxantActionofChloroformExtractsfromLeavesofIndocalamustessellatusonMouseAirwaySmoothMuscle

ShenJinhua,TanHonghao，LeiJun

(Institute for Medical Biology & Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China, College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074, China)

Q474;R734.2

A

1672-4321(2017)03-0027-04

2017-03-31

沈金花(1975-), 女, 教授, 研究方向：疾病相關(guān)基因的功能, E-mail：shenjinhua2013@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170227)；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2012FFA028)