晉曉勇, 張 笛， 蒙麗君， 許凱歌， 雷 杰， 彭 娟

(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021)

1959年，美國(guó)物理學(xué)家Feynman首次提出了分子計(jì)算的思想，預(yù)示著信息處理將從芯片時(shí)代向分子時(shí)代發(fā)展[1]。1994年，Adleman首次通過(guò)試驗(yàn)證明了計(jì)算過(guò)程可在DNA水平進(jìn)行[2]，隨后的幾十年里許多關(guān)于分子邏輯門方面的研究工作不斷被報(bào)道出來(lái)[3 - 4]。分子邏輯門的輸入對(duì)象是在分子或超分子水平上實(shí)施的兩個(gè)或兩個(gè)以上的復(fù)雜操作，輸出信號(hào)為相應(yīng)操作所得到的邏輯信號(hào)，使這個(gè)信號(hào)適用于“1”和“0”二進(jìn)制布爾邏輯運(yùn)算，從而實(shí)現(xiàn)數(shù)字運(yùn)算[5]。計(jì)算機(jī)的構(gòu)建以邏輯運(yùn)算為基礎(chǔ)，要建立和發(fā)展DNA計(jì)算機(jī)，DNA分子邏輯門技術(shù)是一個(gè)不可逾越的必經(jīng)之路[6]。

圖1 雙標(biāo)記探針DNA生物傳感的組裝用于“半加器”的構(gòu)建原理圖Fig.1 Schematic illustration of the dual-signaling DNA biosensor for the "half adder" construction

氧化石墨烯(GO)是在表面修飾有羥基、羧基、環(huán)氧官能團(tuán)的石墨烯[7 - 8]，由于它的親水性和良好的分散性而被廣泛應(yīng)用于傳感器中。Willner課題組[9]利用GO作為有效基底材料，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNAs的放大檢測(cè)并應(yīng)用于邏輯門操作。本實(shí)驗(yàn)介紹了應(yīng)用電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)大腸桿菌(E.coli)DNA和沙門氏菌(Sal)DNA的同時(shí)智能檢測(cè)，原理如圖1所示。在玻碳電極表面修飾GO，然后電沉積金納米粒子(AuNPs)，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則和GO對(duì)DNA單鏈有強(qiáng)的吸附作用實(shí)現(xiàn)對(duì)兩個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于布爾邏輯運(yùn)算，以兩種DNA序列作為輸入，其存在時(shí)定義為“1”，反之為“0”。檢測(cè)各種狀態(tài)的電化學(xué)信號(hào)，設(shè)置恰當(dāng)?shù)拈撝担瑯?gòu)建“AND”型和“XOR”型DNA分子邏輯門，在此基礎(chǔ)上提出了一種新型的具有邏輯運(yùn)算功能的半加器(Half adder)模型。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI760E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；Exceed-E-UV超純水儀(成都唐氏康寧科技公司)；JSM7500F場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(日本，電子公司)。

HAuCl4·3H2O(Au≥48%)、Tris-HCl(超純，阿拉丁生化科技股份有限公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津大茂試劑廠)，所有試劑除特殊說(shuō)明外均為分析純。寡核苷酸序列購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，具體序列見(jiàn)表1。溶解在10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.4，含有100 mmol·L-1NaCl)中，配成10 μmol·L-1的DNA溶液，充分搖勻后于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用寡核苷酸序列Table 1 Sequence of oligonucleotides used in this study

1.2 電極處理與修飾

將玻碳電極(GCE，直徑2.0 mm)用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末在麂皮上連續(xù)拋光至光滑鏡面，超純水沖洗，在HNO3(1+1)、無(wú)水乙醇和超純水中分別超聲3 min，吹干、備用。

GO按照文獻(xiàn)方法[10]制備。使用前將0.10 mg的GO在1.00 mL超純水中超聲分散20 min，制得0.10 mg·mL-1的淺黑色GO懸浮液，移取5.0 μL的GO懸浮液滴在處理干凈的GCE表面，紅外燈烤干，得到GO修飾的GCE，記作GO/GCE。將GO/GCE放入6.0 mmol·L-1HAuCl4(含0.10 mol·L-1KCl)溶液中，在-0.2 V的電位下用恒電位法電沉積2 min，取出用超純水沖洗，吹干，得到GO/AuNPs/GCE。吸取1 μmol·L-1的P1/C1、P2/C2 DNA混合液，退火處理后，滴在GO/AuNPs/GCE表面，避光保存2 h，用20 mmol·L-1pH=7.4的Tris-HCl緩沖液沖洗電極表面，除去未吸附的DNA分子，制得DNA生物傳感器。

圖2 不同電極在電化學(xué)阻抗譜在10 mmol·L-1 PBS(含有 0.10 mol·L-1 KCl，5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-)Fig.2 Nyquist diagrams of the different electrodes in 10 mmol·L-1 PBS (containing 0.10 mol·L-1 KCl,5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-)(a) Bare GCE:(b) GO/GCE;(c) GO/AuNPs/GCE;(d)(0,0) input;(e)(1,0) input;(f)(0,1) input;(g)(1,1) input.

1.3 電化學(xué)檢測(cè)

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均采用三電極系統(tǒng)：修飾GCE為工作電極，鉑電極(直徑2 mm)為對(duì)電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。采用循環(huán)伏安法(CV)、方波伏安法(SWV)在10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=7.4，含有140 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1MgCl2)中進(jìn)行檢測(cè)。在-0.6～0.4 V電位窗口下進(jìn)行CV掃描，掃描速度0.1 V·s-1。在-0.6～0.4 V電位窗口下進(jìn)行SWV掃描，脈沖電位為0.04 V，脈沖幅度為0.025 V，頻率10 Hz。電化學(xué)阻抗(EIS)測(cè)量在pH=7.4的10 mmol·L-1PBS(含有0.10 mol·L-1KCl溶液、5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶液、5.0 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]溶液)中進(jìn)行，電位為0.187 V，振幅為0.05 V，頻率范圍為1 Hz～100 kHz。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同修飾電極的表征

圖2是傳感器在不同組裝階段和不同邏輯輸入狀態(tài)下的交流阻抗圖。曲線a為裸GCE，阻抗很小，電子傳遞效率很高；曲線b為GO/GCE，阻抗增大，因?yàn)镚O修飾導(dǎo)致電子傳遞效率降低；曲線c為GCE/GO/AuNPs，阻抗明顯小于GO/GCE的阻抗，由于AuNPs的引入，大大提高了電子傳遞效率，以上結(jié)果說(shuō)明電極的成功組裝；曲線d為(0，0)輸入，P1/C1，P2/C2形成部分互補(bǔ)的雙鏈“站立”在電極表面，由于電極表面的負(fù)電荷密度增加，降低了[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面的電子傳遞效率，導(dǎo)致阻抗增大；曲線e和f分別為(1，0)輸入和(0，1)輸入狀態(tài)，E.coli DNA與C1，Sal DNA與C2分別完全互補(bǔ)雜交形成雙鏈從電極表面解離，使游離的P1、P2單鏈分別吸附在電極表面，由于DNA單鏈自由伸展且?guī)в胸?fù)電荷，與帶負(fù)電的[Fe(CN)6]3-/4-靜電排斥，導(dǎo)致電子傳遞受阻，故阻抗相比(0，0)輸入有所增加；曲線g為(1，1)輸入，同時(shí)加入E.coli DNA和Sal DNA時(shí)，由于雜交反應(yīng)的發(fā)生使得游離的P1和P2單鏈都被吸附在電極表面，進(jìn)一步阻礙電極表面的電子傳遞，阻抗增加。

圖3所示為不同修飾電極的掃描電鏡(SEM)圖：(A)為裸GCE，由圖可知GCE表面光滑，表明電極處理干凈；(B)為GO/GCE，可以觀察到GO典型的褶皺結(jié)構(gòu)；(C)為/GO/AuNPs/GCE，可以觀察到在GO褶皺表面存在納米金，粒徑約為100 nm；(D)為固定標(biāo)記探針后的電極，可以觀察到DNA分子的存在使AuNPs發(fā)生團(tuán)簇。

圖3 不同電極的掃描電鏡(SEM)圖Fig.3 SEM images of different electrodes(A) Bare GCE;(B) GO/GCE;(C) GO/AuNPs/GCE;(D) GO/AuNPs/GCE with probes immobilized.

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

考察了修飾電極以及目標(biāo)物雜交時(shí)間對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響。圖4(A)為不同修飾電極的電化學(xué)響應(yīng)情況，曲線a為GO/GCE;曲線b為GO/AuNPs/GCE，探針修飾2 h，(1，1)輸入情況下，目標(biāo)物雜交時(shí)間相同，曲線b的信號(hào)明顯強(qiáng)于曲線a，說(shuō)明AuNPs的存在增大了電極的比表面積使得結(jié)合探針的量增加，且自身良好的電子傳遞功能有助于增強(qiáng)MB和Fc在體系中的電化學(xué)信號(hào)。因此選擇GO/AuNPs/GCE修飾電極。圖4(B)為目標(biāo)物雜交時(shí)間的優(yōu)化，在生物傳感器上滴加10 μL 1.0 μmol·L-1的E.coli DNA和Sal DNA混合液，每隔1 h測(cè)定一次，F(xiàn)c的信號(hào)先緩慢增大，3 h時(shí)幾乎達(dá)到平穩(wěn)，但4 h后又急劇下降；MB的信號(hào)也是先增大，4 h時(shí)幾乎達(dá)到平穩(wěn)，之后無(wú)明顯變化(插圖所示)，因此選擇雜交時(shí)間為4 h。

圖4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of detection conditions(A) Choice of different modified electrodes,(a) GO/GCE and (b) GO/AuNPs/GCE;(B) Effect of target hybridization time on the response of biosensor.

2.3 不同輸入狀態(tài)的循環(huán)伏安法和方波伏安法的檢測(cè)

在最優(yōu)條件下對(duì)不同輸入狀態(tài)進(jìn)行CV和SWV的表征，結(jié)果如圖5所示。(0，0)輸入時(shí)，P1/C1，P2/C2分別形成部分雜交的雙鏈“站立”在電極表面，F(xiàn)c和MB距離電極表面較遠(yuǎn)，電子傳遞較慢，檢測(cè)到很弱的Fc和MB的信號(hào)(曲線a)；(1，0)輸入時(shí)，E.coli DNA與C1形成DNA雙鏈從電極表面解離，置換出的P1單鏈吸附在電極表面，MB與電極表面的距離減小，MB的信號(hào)增強(qiáng)，F(xiàn)c信號(hào)基本保持不變；(0，1)輸入時(shí)，C2與Sal DNA形成雙鏈而從電極表面解離，置換出的P2單鏈完全吸附在電極表面，F(xiàn)c與電極表面的距離減小，F(xiàn)c的信號(hào)增強(qiáng)，MB信號(hào)基本保持不變；(1，1)輸入時(shí)，E.coli DNA與C1，Sal DNA與C2完全互補(bǔ)都形成雙鏈從GO表面解離，置換出游離的P1和P2單鏈吸附在電極表面，MB和Fc與電極表面的距離接近，因此MB和Fc的信號(hào)都會(huì)增大(曲線d)。

圖5 邏輯門不同輸入狀態(tài)的循環(huán)伏安(CV)曲線(A)和方波伏安(SWV)曲線(B) Fig.5 CV curves(A) and SWV curves (B) of the logic gates under different inputs state (a)(0,0) input;(b)(1,0) input;(c)(0,1) input;(d)(1,1) input.

2.4 “AND”型和“XOR”型分子邏輯門的構(gòu)建

以E.coli DNA和Sal DNA作為輸入，以Σ|ΔI|(Σ|ΔI|=|ΔIFc|+|ΔIMB|，ΔI=I-I0，I為加入目標(biāo)物后的電流信號(hào)，I0為加入目標(biāo)物前的電流信號(hào))作為輸出，設(shè)定15 μA為閾值，當(dāng)X>15 μA時(shí)，輸出為1；當(dāng)X<15 μA時(shí)，輸出為0，構(gòu)建“AND”型DNA分子邏輯門。真值表如圖6(B)所示。

(B)

InputsE.coliSalOutputX000100010111

圖6“AND”邏輯門的構(gòu)建結(jié)果。(A)SWN檢測(cè)Σ[Δ]的柱狀圖；(B)邏輯門的真值表

Fig.6Theresultof"AND"logicgate.(A)ThebardiagramsΣ|ΔI|detectionbySWV,

thedottedlineindicatesthethreshold(15μA)；(B)Thetruth
Tableof"AND"logicgate

以E.coli DNA和Sal DNA作為輸入，以“Y=|ΔIMB/ΔIFc|”作為輸出，設(shè)定閾區(qū)間為0.5～1.5，而當(dāng)Y>1.5或Y<0.5時(shí)，輸出為1；當(dāng)Y∈(0.5，1.5)時(shí)，輸出為0，構(gòu)建“XOR”型DNA分子邏輯門。真值表如圖7(B)所示。

(B)

InputsE.coliSalOutputX000101011110

圖7“XOR”型邏輯門的構(gòu)建結(jié)果。(A)SWN檢測(cè)|ΔIMB/ΔIFC|柱狀圖；(B)“XOR”邏輯門的真值表

Fig.7Theresultof"XOR"logicgate.(A)Thebardiagrams|ΔIMB/ΔIFc|detectionbySWV,

thedottedlineindicatesthethresholdrange(0.5-1.5)；(B)Thetruth
Tableof"XOR"logicgate

2.5 半加器的構(gòu)建

將所構(gòu)建的“AND”邏輯門和“XOR”邏輯門整合起來(lái)構(gòu)建成具有邏輯功能的半加器(Half adder)。半加器分析兩種分子信號(hào)并根據(jù)以下的規(guī)則輸出兩種不同的分子信號(hào)：(1)沒(méi)有輸入信號(hào)時(shí)，系統(tǒng)沒(méi)有變化，也沒(méi)有輸出；(2)當(dāng)有一個(gè)輸入分子信號(hào)時(shí)，只激活和位輸出(sum bit output)；(3)當(dāng)有兩種輸入信號(hào)時(shí)，只激活進(jìn)位輸出(carry bit output)。和位輸出的功能是由“XOR”邏輯門執(zhí)行，而進(jìn)位輸出是由“AND”邏輯門執(zhí)行。半加器只考慮兩個(gè)一位二進(jìn)制數(shù)的相加，而不考慮來(lái)自低位進(jìn)位數(shù)的運(yùn)算電路。真值表見(jiàn)表2。

表2 半加器的真值表Table 2 The truthTable for half adder

2.6 DNA生物傳感器的檢測(cè)范圍及檢出限

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)兩種目標(biāo)DNA進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖8所示，E.coli DNA和Sal DNA的濃度均在1.0×10-13～1.0×10-8mol·L-1范圍內(nèi)，目標(biāo)物濃度的對(duì)數(shù)和Σ|ΔI|(Fc和MB信號(hào)變化之和)呈良好的線性關(guān)系，其線性方程分別為：Σ|ΔI|=32.03+2.17logcE.coli(c:mol·L-1,R=0.9931)，Σ|ΔI|=34.14+2.49logcSal(c:mol·L-1,R=0.9967)，檢出限(S/N=3)分別為 3.2×10-14mol·L-1和1.7×10-14mol·L-1。

圖8 (a)不同濃度的E.coli DNA的方波伏安(SWV)圖；(B)不同濃度的Sal DNA的方波伏安(SWV)圖 Fig.8 (a) SWV responses with different concentration of E.coli DNA;(B) SWV responses with different concentration of Sal DNA From a to f:the concentration was 1.0×10-13,1.0×10-12,1.0×10-11,1.0×10-10,1.0×10-9 and 1.0×10-8 mol·L-1.

2.7 傳感器選擇性、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性的考察

為考察該生物傳感器的選擇性，分別檢測(cè)了加入目標(biāo)序列(Target)、一個(gè)堿基錯(cuò)配(OM)、完全錯(cuò)配(NCM)的DNA序列的響應(yīng)。當(dāng)加入錯(cuò)配堿基序列時(shí)，信號(hào)明顯比加入目標(biāo)序列時(shí)的信號(hào)弱很多，這是由于錯(cuò)配的DNA無(wú)法與相應(yīng)的互補(bǔ)序列發(fā)生特異性雜交，不僅無(wú)法打開(kāi)P1/C1，P2/C2鏈，而且還占據(jù)了GO表面更多的位點(diǎn)，結(jié)果表明該傳感器具有較好的選擇性。

按照1.2所述制備生物傳感器，兩目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)，且將此電極儲(chǔ)存在4 ℃的冰箱中一周后，再用SWV法檢測(cè)，其響應(yīng)信號(hào)沒(méi)有發(fā)生很大變化，表明該DNA傳感器穩(wěn)定性良好。采用同樣的修飾方法制備了三支相同的生物傳感器，在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，SWV方法檢測(cè)(1，1)輸入狀態(tài)的電化學(xué)響應(yīng)，計(jì)算的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.8%，表明該DNA傳感器重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

本研究采用滴涂法和電沉積法制備了氧化石墨烯/金納米粒子復(fù)合膜修飾玻碳電極作為工作電極，F(xiàn)c和MB作為電化學(xué)指示劑，以E.coli DNA和Sal DNA作為目標(biāo)分子，構(gòu)建了標(biāo)記型DNA生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)E.coli DNA和Sal DNA的同時(shí)智能分析，檢測(cè)范圍均在1.0×10-13～1.0×10-8mol·L-1，檢出限(S/N=3)分別為3.2×10-14mol·L-1和1.7×10-14mol·L-1。研究結(jié)果表明此電化學(xué)傳感器具有穩(wěn)定性好、易制備、成本低和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，所建立的分析方法具有高的靈敏度和較寬的線性范圍。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以E.coli DNA和Sal DNA作為輸入，探針信號(hào)變化之和Σ|ΔI|作為輸出構(gòu)建了“AND”型DNA分子邏輯門，以探針信號(hào)變化之比|ΔIMB/ΔIFc|作為輸出構(gòu)建了“XOR”型DNA分子邏輯門，提出了一種新型的半加器模型，可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)二進(jìn)制數(shù)字相加運(yùn)算。