許 賀, 許雙姐, 柳建設(shè), 金利通

(1.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 201620; 2.華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200062)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類具有致癌、致畸和致突變的持久性有機(jī)化合物，它在環(huán)境中極難降解和消除，已有16種PAHs被美國環(huán)境保護(hù)署(USEPA)列為優(yōu)先控制污染物[1]。其中，1-芘丁酸(PBA)是芘類PAHs最常見的衍生物，對(duì)人體的血液、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等存在嚴(yán)重危害。因此，PAHs及其衍生物的快速檢測(cè)對(duì)于保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，測(cè)定PAHs及衍生物的主要方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法等。這些方法雖然具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但前處理麻煩，成本較高，操作復(fù)雜，且不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[2]。近年來，電化學(xué)免疫傳感器作為一種有效的微量和痕量分析手段，基于抗原與抗體的特異性反應(yīng)和電化學(xué)檢測(cè)的特點(diǎn)[3 - 4]，具有常規(guī)理化分析技術(shù)無可比擬的高選擇性和高靈敏度，非常適合于復(fù)雜基質(zhì)中的痕量組分分析[5]。同時(shí)還具有價(jià)格便宜，前處理方法簡(jiǎn)單，分析速度快，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，不需要光源、光柵等光學(xué)元件，設(shè)備和檢測(cè)原理相對(duì)簡(jiǎn)單，更易做到集成化和小型化[6]，為突發(fā)污染事件的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了重要方法。

本文采用成膜性極好的殼聚糖(CS)分散具有大比表面積和導(dǎo)電性高的石墨烯(GS)作為平臺(tái)，并結(jié)合生物兼容性極好的納米金(Nano-Au)固定抗體，構(gòu)建性能良好的生物識(shí)別界面，制備一種無標(biāo)記的電流型免疫傳感器，并應(yīng)用于PAHs衍生物PBA的高靈敏檢測(cè)。該免疫傳感器具有制作過程簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)痕量PBA檢測(cè)具有良好的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

CHI 660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；JEM-2100透射電子顯微鏡(日本，JEOL)。

多環(huán)芳烴抗體(Mouse Monoclonal BAP-13，美國Abcam公司)。研究表明，該anti-PAHs抗體對(duì)PBA具有優(yōu)異的特異性和親和性，交叉反應(yīng)率達(dá)205%[7]。其它試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Nano-Au按照文獻(xiàn)方法[8]制備。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 電化學(xué)免疫傳感器的制備

采用玻碳電極(GCE，直徑3 mm)作為基底電極，用0.05 μm的Al2O3粉末仔細(xì)打磨拋光成鏡面，并先后于HNO3(1+1)、無水乙醇和蒸餾水中各超聲5 min,最后將電極在室溫下晾干。將0.02 g CS加入100 mL 1%的HAc水溶液中，持續(xù)攪拌至無氣泡，得透明CS溶液。在10 mL蒸餾水中加入0.1 g GS，超聲得到分散均勻的GS懸濁液。取5 mL該懸濁液加入上述CS溶液中，超聲分散0.5 h，得到GS-CS懸濁液。在靜電吸附自組裝GS-CS之前，先將GCE放入0.5 mol/L H2SO4中，于-0.3～+1.5 V 范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描進(jìn)行電化學(xué)氧化預(yù)處理，在氮?dú)夥諊栏伞Ｈ缓笕?0 μL的GS-CS溶液滴于GCE表面，在室溫下自然晾干。取10 μL已制備好并且超聲分散的Nano-Au溶液，滴涂在電極表面，室溫下放置40 min后，將10 μL anti-PAHs滴于電極上，于35 ℃孵育30 min后，將電極于37 ℃下浸泡在3%(m/m)的BSA/PBS(pH=7.4)溶液中30 min，以封閉活性基團(tuán)，得到GS-CS-Nano-Au修飾的電化學(xué)免疫傳感器，于4 ℃保存待用(圖1)。

圖1 免疫傳感器的制備過程Fig.1 Fabrication steps of the immunosensors

1.3 電化學(xué)表征和檢測(cè)

利用循環(huán)伏安法表征電極在修飾過程中不同階段的電化學(xué)性能。采用三電極體系，電化學(xué)免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極，于0.1 mol/L KCl + 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH=7.0)的測(cè)試底液中，在-0.2～+0.6 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速為50 mV/s。電化學(xué)免疫傳感器在含不同濃度的PBA溶液中，于35 ℃條件下孵育30 min后，進(jìn)行DPV測(cè)量，脈沖范圍為-0.2～+0.6 V，間隔時(shí)間為50 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極修飾材料的透射電鏡(TEM)表征

圖2為GS(A)和GS-CS(B)復(fù)合物的透射電子顯微鏡(TEM)表征圖。如圖2(B)所示，GS均勻分散在CS中，該表征結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[9]相一致。圖2(C)為Nano-Au的TEM表征圖，可看出顆粒大小均勻，分散性良好，幾乎沒有重疊現(xiàn)象，粒徑大小約為16 nm。

圖2 石墨烯(A)、石墨烯-殼聚糖(B)和納米金(C)的透射電鏡(TEM)圖Fig.2 TEM images of GS(A),GS-CS composites(B) and Nano-Au(C)

2.2 免疫傳感器的電化學(xué)表征

圖3 不同電極在0.1 mol/L KCl + 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of the different electrodes in 0.1 mol/L KCl+5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH=7.0)(a) bare GCE;(b) GS-CS/GCE;(c) Nano-Au-GS-CS/GCE;(d) anti-PAHs/Nano-Au-GS-CS/GCE;(e) BSA/anti-PAHs/Nano-Au-GS-CS/GCE.

為了證實(shí)GS-CS-Nano-Au修飾電極具有更大的電活性面積和更快的電子轉(zhuǎn)移速率，采用Randles-Sevcik方程進(jìn)行計(jì)算。從圖3可看出，F(xiàn)e3+/Fe2+電對(duì)在Nano-Au-GS-CS/GCE上展現(xiàn)了最好的電流響應(yīng)。根據(jù)Randles-Sevcik方程[12]，電極的電活性面積由以下方程式求出：Ip=2.69×105AD1/2n3/2γ1/2C。其中，n為參與氧化還原反應(yīng)的電子數(shù)，A為有效電極面積(cm2)，D為擴(kuò)散系數(shù)(cm2/s)，γ是電位變化速率(V/s)。本實(shí)驗(yàn)用到的[Fe(CN)6]4-/3-是電化學(xué)中使用最廣泛的氧化還原體系，顯示了不同種類的單電子轉(zhuǎn)移(n=1)。C為5 mmol/L，擴(kuò)散系數(shù)(D)為6.7×10-6cm2/s。根據(jù)計(jì)算，Nano-Au-GS-CS/GCE、GS-CS/GCE 、CS/GCE和裸GCE的電活性面積分別為0.184 cm2、0.139 cm2、0.031 cm2和0.066 cm2。由此可見，CS大大提高了修飾電極的比表面積和電化學(xué)性能，GS-CS修飾的電極活性面積約為裸電極活性面積的2倍，Nano-Au的存在進(jìn)一步提高了電極的電化學(xué)性能，電極活性面積最大，約為裸電極活性面積的3倍。

圖4 電化學(xué)免疫傳感器在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of the anti-PAHS/Nano-Au-GS-CS/GCE at the different scan rates

圖4為anti-PAHs/Nano-Au-GS-CS/GCE電化學(xué)免疫傳感器在0.1 mol/L KCl+5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH=7.0)測(cè)試底液中，以不同掃速進(jìn)行掃描得到的循環(huán)伏安圖。由圖4可以看出，隨著掃速的增加，氧化還原峰電流明顯的增加，在10～500 mV/s的掃速范圍內(nèi)，其峰電流與掃速的平方根成良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：ipc=9.206v1/2+66.58，R2=0.9965和ipa=-9.508v1/2-56.58，R2=0.9926說明該電極反應(yīng)受擴(kuò)散過程控制。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1抗體濃度和pH對(duì)免疫傳感器性能影響圖5A為抗體濃度對(duì)免疫傳感器測(cè)定電流的影響。隨著抗體濃度的增加，固定到免疫傳感器上的anti-PAHs量增多，電極表面的阻抗增加，從而使峰電流減小。在抗體濃度大于100 μg/mL時(shí)，峰電流值不再繼續(xù)減小，說明此濃度下的抗體在電極表面的固定量達(dá)到飽和。傳感器界面抗體的結(jié)合位點(diǎn)有限，若繼續(xù)加大抗體的濃度，則會(huì)出現(xiàn)抗體量過?，F(xiàn)象，因此，選擇100 μg/mL的抗體溶液濃度作為最佳抗體濃度。

測(cè)試底液的pH對(duì)免疫傳感器的性能也具有重要影響，一方面pH影響蛋白質(zhì)的活性，另一方面pH影響抗體在電極表面的固定。如圖5B所示，pH在6.5～7.5范圍內(nèi)對(duì)抗體的吸附影響不大，且在7.0時(shí)峰電流最大，說明此pH條件下吸附的抗體量最多，蛋白質(zhì)穩(wěn)定。但是pH過大或過小時(shí)，電流值均變小，說明抗體在電極表面的吸附量較少，抗體與普通蛋白質(zhì)一樣，在酸性或堿性條件下可能會(huì)發(fā)生變性[13]?？贵w變性后將形成2個(gè)半分子，從而影響正常的抗原-抗體免疫結(jié)合過程。因此，實(shí)驗(yàn)選擇用pH=7.0的測(cè)試底液。

圖5 抗體濃度(A)和pH值(B)對(duì)電化學(xué)免疫傳感器性能的影響Fig.5 Effects of the concentration of anti-PAHs(A) and pH(B) on the immunosensor

2.3.2孵育時(shí)間和孵育溫度對(duì)免疫傳感器的影響電化學(xué)免疫傳感器與抗原孵育時(shí)間、孵育溫度對(duì)免疫反應(yīng)有重要影響。免疫反應(yīng)時(shí)抗原與抗體需要一定結(jié)合時(shí)間才能形成免疫復(fù)合物，在5～25 min范圍內(nèi)示差脈沖伏安(DPV)響應(yīng)電流的變化隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，說明免疫反應(yīng)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在不斷進(jìn)行。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到達(dá)30 min之后，電流曲線趨于平緩，說明免疫反應(yīng)已基本達(dá)到平衡。因此，實(shí)驗(yàn)選取30 min為孵育時(shí)間。

電化學(xué)免疫傳感器與抗原孵育的溫度也是影響免疫反應(yīng)的一個(gè)重要因素。在溫度15～35 ℃溫度范圍內(nèi)，響應(yīng)電流值隨溫度升高而增大，在35 ℃時(shí)響應(yīng)電流達(dá)到最大值。當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，響應(yīng)電流值反而變小，原因是免疫復(fù)合層受到高溫破壞，抗原抗體的免疫活性降低，免疫復(fù)合物發(fā)生解離，影響了免疫傳感器的性能[14]。因此實(shí)驗(yàn)選取35 ℃為最佳孵育溫度。

圖6 DPV電流響應(yīng)與PBA濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curves of amperometric response to the concentrations of PBA cPBA (a-s):0,0.001,0.05,0.5,1.0,3.0,5.0,7.0,8.5,10,30,60,80,110,120,150,160,170,200 ng/mL.

2.4 免疫傳感器對(duì)1-芘丁酸的DPV檢測(cè)

將PBA用0.1 mol/L PBS(pH=7.4)配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0.1 mol/L KCl + 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH=7.0)的測(cè)試底液中，采用DPV法測(cè)定免疫傳感器在不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)電流值，得到峰電流隨濃度的變化情況(圖6)。優(yōu)化條件下，PBA濃度在0.001～10 ng/mL和10～200 ng/mL范圍內(nèi)，峰電流隨PBA濃度的增加而減小，且與峰電流值呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程分別是：ip1(μA)= 0.105cPBA(ng/mL)-65.49(相關(guān)系數(shù)為0.9994);ip2(μA)=2.221cPBA(ng/mL)-87.26(相關(guān)系數(shù)為0.9900)，檢出限(S/N=3)為0.001 ng/mL。

對(duì)于檢測(cè)的靈敏度，已報(bào)道的PAHs免疫傳感器的靈敏度大多集中在μg級(jí)，本實(shí)驗(yàn)所建立的免疫檢測(cè)方法的靈敏度明顯優(yōu)于已報(bào)道的PAHs生物傳感器。韋明元等[15]采用氧化還原標(biāo)記物標(biāo)記抗原，競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)試苯并芘和PBA，對(duì)PBA的檢出限為10 ng/mL；楊萍[16]采用納米金標(biāo)記法構(gòu)建阻抗型免疫傳感器用于PBA的檢測(cè)，檢測(cè)限為0.03 ng/mL；張巖等[17]構(gòu)建的無標(biāo)記電流型免疫傳感器用于萘的快速檢測(cè)，檢測(cè)范圍0.5～100 ng/mL，檢出限為0.08 ng/mL；也有報(bào)道通過玻碳電極表面直接電化學(xué)氧化來檢測(cè)苯并芘，檢測(cè)范圍在0.25～1.25 mmol，檢出限為0.027 mmol(6.82 ng/mL)[18]。由此可見，本實(shí)驗(yàn)所建立的免疫傳感器有較高的靈敏度，對(duì)于環(huán)境樣品中痕量PBA的檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 免疫傳感器的特異性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

將電化學(xué)免疫傳感器置于10 ng/mL PBA標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育后，測(cè)定DPV響應(yīng)值。然后在PBA標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入100 ng/mL芘、熒蒽、苊和菲溶液，相同條件下孵育后，分別測(cè)定DPV值。電化學(xué)免疫傳感器在PBA標(biāo)準(zhǔn)溶液和4種干擾物中的ip值分別為-64.67、-66.33、-65.19、-63.56和-63.07 μA。實(shí)驗(yàn)表明，在加入干擾物的條件下電流變化不超過3%，說明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

將電化學(xué)免疫傳感器置于0.1 mol/L KCl + 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH=7.0)測(cè)試底液中，連續(xù)掃描200圈，電流響應(yīng)僅下降3.1%。將制備好的電化學(xué)免疫傳感器置于4 ℃密閉保存，相同條件下每2 d進(jìn)行DPV掃描，兩周后電流值為初始電流值的94.6%，基本無變化，表明該免疫傳感器更具穩(wěn)定性。測(cè)試不同批次制備的20支電化學(xué)免疫傳感器對(duì)10g/L PBA的電流響應(yīng)，所得的PBA濃度為9.78g/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.2%，表明該免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

取自來水、河水和湖水，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后，分別加入PBA標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成不同濃度的加標(biāo)試樣，以本實(shí)驗(yàn)所制備的免疫傳感器，用DPV法檢測(cè)PBA的含量，相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。從表中可知，回收率在90%～104.9%之間，RSD在0.5%～3.8%范圍內(nèi)，表明該免疫傳感器準(zhǔn)確性良好，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

表1 電化學(xué)免疫傳感器的回收率Table 1 Recoveries of PBA in spiked sample by the proposed electrochemical immunosensor

3 結(jié)論

本文制備了石墨烯-殼聚糖-納米金修飾的免疫傳感器用于1-芘丁酸的檢測(cè)。石墨烯-殼聚糖復(fù)合膜明顯提高了免疫傳感器的穩(wěn)定性和導(dǎo)電性；而納米金的協(xié)同作用，進(jìn)一步提高抗體在電極的固定量，大大提高了免疫傳感器的靈敏度和檢測(cè)性能。該方法所制備的免疫傳感器對(duì)1-芘丁酸的檢測(cè)具有較寬的線性范圍和較低的檢測(cè)限，選擇性和重現(xiàn)性良好，而且簡(jiǎn)單快速、制備費(fèi)用低，對(duì)環(huán)境中痕量PBA的檢測(cè)具有潛在應(yīng)用價(jià)值。