穆敏婕，陳換飛， 陳 婷， 段醒妹，張梅*

·炮制制劑·

吡唑類活性物質(zhì)XY-4陽離子脂質(zhì)體的包封率測(cè)定研究

穆敏婕1，陳換飛1， 陳 婷1， 段醒妹2*，張梅1*

目的：研究XY-4陽離子脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法。方法：采用薄膜法制備XY-4陽離子脂質(zhì)體；用超濾離心法分離脂質(zhì)體和藥物，并用高效液相色譜法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率。結(jié)果：制得的脂質(zhì)體包封率為84.6%；XY-4檢測(cè)濃度的線性范圍為20-100 μg．mL-1；平均回收率為99.8%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于XY-4陽離子脂質(zhì)體的包封率的測(cè)定。

XY-4陽離子脂質(zhì)體；包封率；高效液相色譜法

Aurora 激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括Aurora –A、Aurora –B和Aurora –C。其中Aurora-A激酶通常位于中心體和紡錘體上，由于對(duì)于牽引分裂中的染色體向兩極移動(dòng)具有重要意義，常常被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，近年來作為抗腫瘤靶點(diǎn)受到人們的廣泛關(guān)注。我們前期以Aurora-A激酶為靶點(diǎn)，計(jì)算機(jī)藥物輔助設(shè)計(jì)為手段，設(shè)計(jì)并合成了一系列吡唑 [3,4-b] 吡啶類化合物，并發(fā)現(xiàn)了XY-4（結(jié)構(gòu)如圖1所示）對(duì)多種不同組織來源的腫瘤細(xì)胞如結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞等具有抑制細(xì)胞增殖的作用[1]。但是XY-4不溶于水，影響了后期的進(jìn)一步開發(fā)研究。藥物的溶解度是許多新藥研發(fā)中關(guān)注的首要問題，由于難溶于水，即使其飽和溶液也難以達(dá)到有效的治療濃度，所以改變藥物的溶解度對(duì)新藥的研發(fā)有著重要的意義[2]。我們將化合物XY-4制備成了一種陽離子脂質(zhì)體，不僅解決了其水溶性問題，還由于陽離子脂質(zhì)體的表面攜帶正電荷可以與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜通過靜電作用結(jié)合，更易為目標(biāo)細(xì)胞攝取而發(fā)揮作用。

對(duì)于脂質(zhì)體而言，包封率是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體制備和工藝的重要指標(biāo)之一，也是脂質(zhì)體能否發(fā)揮較普通制劑更高效、緩釋等優(yōu)點(diǎn)的關(guān)鍵所在，它反映了被包裹在脂質(zhì)體囊泡中的藥物占脂質(zhì)體混懸液中藥物總量的比例[3]，因此建立一種科學(xué)合理、簡(jiǎn)便易行的方法是很有必要的。

本文采用薄膜法制備出了XY-4陽離子脂質(zhì)體，并參考文獻(xiàn)[3～8]，采用超濾離心法對(duì)其包封率進(jìn)行測(cè)定。該法準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，為XY-4陽離子脂質(zhì)體的后續(xù)體內(nèi)外進(jìn)一步研究提供了保障。

圖1 XY-4 結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(tǒng)E2695及PDA檢測(cè)器（美國waters公司）；EYELA-1200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；JA1003型電子天平（上海順宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；高速離心機(jī)（賽默飛）；超濾離心管 （Millipore）

XY-4對(duì)照品及原料藥（實(shí)驗(yàn)室自制，含量＞98%）；DOTAP（Avanti Polar Lipids, INC）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，所用超純水均為實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)制備（Millipore）。

2 方法與結(jié)果

2.1 XY-4陽離子脂質(zhì)體的制備

采用薄膜法制備XY-4陽離子脂質(zhì)體。將DOTAP和XY-4按照質(zhì)量比20:1完全溶解于適量三氯甲烷中，轉(zhuǎn)移到梨形瓶中，在55 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h，除去有機(jī)溶劑，在瓶壁形成一層薄膜后于真空干燥箱中過夜。加入超純水作為水相，55 ℃旋轉(zhuǎn)水化30 min，用超純水定容即得到一定濃度的XY-4陽離子脂質(zhì)體?？瞻字|(zhì)體按照相同的方法制備。XY-4陽離子脂質(zhì)體的平均粒徑在91.3 nm（見圖2）。

圖2 XY-4陽離子脂質(zhì)體的粒徑分布圖

2.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（75:25）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫設(shè)置為30 ℃。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的XY-4對(duì)照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇溶解并定容至刻度，搖勻配得含XY-4 1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取相應(yīng)體積的XY-4儲(chǔ)備液，分別置于2 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻稀釋成濃度分別為100、90、80、60、40、20 μg/mL的對(duì)照品系列溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后取續(xù)濾液進(jìn)樣，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積。以XY-4的檢測(cè)濃度（C）為橫坐標(biāo)，以各濃度下測(cè)定的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=7093.9X-4606.5（r=0.9999）。結(jié)果表明，XY-4檢測(cè)濃度在20-100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取濃度分別為0.025、0.05、0.100 mg/mL 的對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD值分別為1.02%。表明該儀器精密度良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密量取濃度為1.0 mg/mL 的對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置于5 mL的容量瓶中，分別加入空白脂質(zhì)體0.5 mL，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后取續(xù)濾液進(jìn)樣，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，XY-4的平均回收率為99.8%，RSD=1.24%。

2.7 包封率測(cè)定

2.7.1 樣品的制備 取“2.1”項(xiàng)下制備的XY-4陽離子脂質(zhì)體200 μL，加入2 mL甲醇溶液，超聲破壞3 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后作為工作液。按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定XY-4脂質(zhì)體中的XY-4總含量。

將XY-4陽離子脂質(zhì)體用超濾離心管在一定轉(zhuǎn)速下離心一定時(shí)間，取離心下的液體100 μL加入400 μL色譜甲醇溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定脂質(zhì)體中游離XY-4的含量。根據(jù)以下公式計(jì)算XY-4陽離子脂質(zhì)體的包封率：

2.7.2 不同超濾時(shí)間對(duì)包封率測(cè)定的影響 各取同一批XY-4陽離子脂質(zhì)體0.5 mL置于超濾管中，4000 rpm．min-1分別離心5 min、10 min、20 min和30 min，測(cè)定濾液中游離的藥物量，計(jì)算包封率。結(jié)果見表1，離心時(shí)間在10 min之后測(cè)得的包封率基本無變化，所以超濾時(shí)間選擇為10 min。

表1 不同超濾時(shí)間測(cè)得包封率結(jié)果

2.7.3 不同超濾轉(zhuǎn)速對(duì)包封率的影響 各取同一批XY-4陽離子脂質(zhì)體0.5 mL置于超濾管中，分別在4000、6000和8000 rpm．min-1超濾離心10 min，測(cè)定濾液中游離的藥物量，計(jì)算包封率。結(jié)果見表2，轉(zhuǎn)速在6000和8000 rpm．min-1時(shí)測(cè)得的包封率基本無變化，所以超濾轉(zhuǎn)速選擇為4000 rpm．min-1。

表2 不同超濾離心轉(zhuǎn)速測(cè)得包封率結(jié)果

2.7.4 超濾膜對(duì)藥物吸附性考察 精密移取XY-4對(duì)照品儲(chǔ)備液，用色譜甲醇稀釋成100、50、25 μg/mL三種濃度，各取0.5 mL于超濾離心管中，4000 rpm．min-1離心10 min，取濾液過0.45 μm微孔濾膜，按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定XY-4含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3，可認(rèn)為超濾膜對(duì)XY-4無吸附。

表3 不同濃度XY-4溶液經(jīng)超濾后的回收率結(jié)果

2.7.5 XY-4陽離子脂質(zhì)體包封率的測(cè)定 選取同一批制備的XY-4陽離子脂質(zhì)體按照“2.7.1”項(xiàng)下樣品處理方法處理后，采用HPLC在選定的色譜條件下測(cè)定XY-4的總含量，再用超濾離心法4000 rpm?min-1離心10min并處理后測(cè)定游離XY-4的量，計(jì)算包封率。結(jié)果測(cè)得的XY-4的平均包封率為84.6%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用陽離子脂質(zhì)DOTAP作為脂質(zhì)層通過薄膜法制備了XY-4陽離子脂質(zhì)體，得到的脂質(zhì)體粒徑較小，分布均勻。包封率的測(cè)定中分離脂質(zhì)和游離藥物的方法較多，主要包括葡聚糖凝膠法、透析法、超速離心法、離子交換樹脂法等。相比較葡聚糖凝膠法的操作復(fù)雜、耗時(shí)、藥物損耗較大。考慮到操作簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、耗時(shí)短，可有效分離游離藥物和脂質(zhì)體等優(yōu)點(diǎn)，我們選擇了使用超濾離心法對(duì)制備的XY-4陽離子脂質(zhì)體包封率進(jìn)行測(cè)定。超濾法是在離心力作用下利用篩分原理對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。

在測(cè)定包封率之前，我們首先建立了高效液相色譜法測(cè)定XY-4含量的方法，并考察了超濾離心的時(shí)間和轉(zhuǎn)速對(duì)包封率測(cè)定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到4000 rpm．min-1時(shí)，離心10 min測(cè)得的XY-4陽離子脂質(zhì)體的包封率基本穩(wěn)定不再變化，說明在該離心條件對(duì)包封率的測(cè)定較穩(wěn)定。接著我們對(duì)超濾離心管對(duì)XY-4的吸附能力進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該型號(hào)的超濾離心管對(duì)XY-4的吸附＜1%，可認(rèn)為對(duì)XY-4無吸附，不影響包封率的測(cè)定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備出了一種粒徑小且分布均勻的吡唑類活性物質(zhì)XY-4陽離子脂質(zhì)體，并建立了一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單易行的測(cè)定其包封率的方法，對(duì)后續(xù)深入研究具有重要意義。

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(責(zé)任編輯：傅舒)

Study on the encapsulation ef fi ciency of cationic liposome of pyrazole active substance XY-4 /

MU Min-jie1, CHEN Huanfei2, CHEN Ting2, DUAN Xing-mei2, ZHANG Mei1//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, Sichuan)

Objective:To study the method of determination of the entrapment efficiency of XY-4 cationic liposome.Method:XY-4 cationic liposome was prepared by fi lm method. Liposome and drug were separated by ultra fi ltration centrifugation,and the encapsulation efficiency of liposome was detected by high performance liquid chromatography (HPLC).Result:The encapsulation ef fi ciency of liposome was 84.6%. The linear range of XY-4 was 20～100 μg．mL-1. And the average recovery was 99.8%.Conclusion:The method is simple, accurate and reproducible, and can be used for the determination of the encapsulation ef fi ciency of XY-4 cationic liposomes.

XY-4 cationic liposome; entrapment ef fi ciency; HPLC

R285.5

A

1674-926X(2017)03-007-03

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 成都 611137；2 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院 成都 610072

穆敏婕（1992-），女，在讀碩士研究生

Tel:13540439524 Email:1552618356@qq.com

張梅，藥物分析教授

Tel:028-61800231 Email:zhangmei63@126.com段醒妹，藥劑學(xué)助理研究員

Tel:028-87393999 Email:2323272961@qq.com

2016-6-22