李國亮 錢 偉 張淑江 李 菲 章時(shí)蕃 張 慧 謝露露 武 劍王曉武 孫日飛

利用改良SOE-PCR技術(shù)定點(diǎn)突變TuMV C4-VPg基因

李國亮 錢 偉 張淑江 李 菲 章時(shí)蕃 張 慧 謝露露 武 劍王曉武 孫日飛*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）是白菜類蔬菜生產(chǎn)上的重要病害，其中TuMV VPg基因在TuMV侵染白菜類蔬菜的過程中起著至關(guān)重要的作用，且不同TuMV株系的致病性不同。本試驗(yàn)采用改良的重疊延伸PCR（SOE-PCR）技術(shù)，以TuMV C4-VPg基因序列為模板，定點(diǎn)突變TuMV C4-VPg與TuMV CDN1-VPg基因間5個(gè)差異核苷酸位點(diǎn)（決定5個(gè)氨基酸差異）。結(jié)果表明：通過SOE-PCR技術(shù)獲得了5個(gè)TuMV C4-VPg基因的單點(diǎn)突變體，即TuMV C4-VPg-Ⅰ、TuMV C4-VPg-Ⅱ、TuMV C4-VPg-Ⅲ、TuMV C4-VPg-Ⅳ和TuMV C4-VPg-Ⅴ。

白菜類蔬菜；蕪菁花葉病毒；VPg基因；重疊延伸PCR技術(shù)；單點(diǎn)突變

蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）屬于馬鈴薯Y病毒科Y病毒屬，是白菜類蔬菜生產(chǎn)上的主要病害之一。TuMV VPg蛋白是一種多功能蛋白，共價(jià)連接在病毒RNA的5′末端，類似帽子結(jié)構(gòu)，在病毒復(fù)制的過程中起重要作用（Miyoshi et al.，2008），可與寄主擬南芥的翻譯起始因子eIF（iso）4E互作，調(diào)控病毒RNA翻譯的起始（Duprat et al.，2002）。Gallois等（2010）通過酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)寄主翻譯起始因子eIF（iso）4E可以與VPg蛋白互作，通過調(diào)控病毒翻譯的起始，從而對(duì)病毒的侵染產(chǎn)生干擾（Wittmann et al.，1997），在擬南芥eIF（iso）4E基因的帽結(jié)合蛋白中，將第46位和第92位氨基酸Trp突變?yōu)長eu后，eIF（iso）4E就不能與病毒VPg互作（Miyoshi et al.，2006）；Dinkova等（2016）發(fā)現(xiàn)辣椒eIF4E的第94位和第107位氨基酸突變后，將影響TuMV VPg與eIF4E的互作，但eIF4E其他位置的突變對(duì)二者的互作沒有影響。由此可知，關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變化對(duì)其功能的表達(dá)具有重要的影響，通過重疊延伸PCR技術(shù)（splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR），可以快速、高效地獲得單點(diǎn)突變體，為驗(yàn)證關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的功能奠定基礎(chǔ)。

重疊延伸PCR技術(shù)利用具有互補(bǔ)末端的特定引物，將兩條PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，在下一輪的擴(kuò)增反應(yīng)中，通過重疊鏈延伸來實(shí)現(xiàn)不同片段的拼接（熊愛生 等，2000；帥勇 等，2009）。該技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶的處理（Horton et al.，1989；Senanayake & Brian，1995），也不受突變位置及突變類型的限制，可以在DNA的任何位點(diǎn)插入突變（Urban et al.，1997；Gang et al.，2011）。重疊延伸PCR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。翟玲等（2012）利用重疊延伸PCR技術(shù)，對(duì)LacZ報(bào)告基因的一些位點(diǎn)隨機(jī)插入目標(biāo)內(nèi)含子，再對(duì)LacZ報(bào)告基因的活性進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明該方法與In-Fusion克隆相比有一定的優(yōu)越性；李諾敏等（2013）利用重疊延伸PCR技術(shù)，對(duì)人tau基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得tau基因的6種同工異構(gòu)體的克隆，進(jìn)而在蛋白水平上驗(yàn)證了tau蛋白表達(dá)。該技術(shù)無需利用限制性內(nèi)切酶，可以對(duì)基因的多個(gè)位置進(jìn)行剪切和連接，具有很大的靈活性和簡便性。

重疊延伸PCR技術(shù)即在體外定點(diǎn)突變基因位點(diǎn)，是一種獲得單點(diǎn)突變基因的技術(shù)。蕪菁花葉病毒（TuMV）侵染白菜類蔬菜后，TuMV VPg蛋白通過與白菜翻譯起始因子eIF（iso）4E互作，促進(jìn)病毒自身的增殖。為了進(jìn)一步闡明不同TuMV株系間VPg基因的差異對(duì)TuMV致病性的影響，本試驗(yàn)采用改良的重疊延伸PCR技術(shù)，以TuMV C4-VPg基因?yàn)槟０?，定點(diǎn)突變核苷酸，克隆了5個(gè)單點(diǎn)突變基因，以期為揭示特定氨基酸位點(diǎn)對(duì)病毒致病機(jī)制的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年9月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分子遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。TuMV C4株系、大腸桿菌trans 5α菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜育種課題保存。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA Marker、DNA Polymerase、DNA 回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；克隆載體pEASY-T1 Cloning Kit購自全式金（北京）有限公司；卡那霉素購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 重疊延伸PCR引物設(shè)計(jì)及第1輪PCR反應(yīng)體系

重疊延伸PCR引物設(shè)計(jì)遵循常規(guī)引物設(shè)計(jì)原則，突變堿基位于引物中央偏3′端，引物長度30 bp左右為佳，引物過短不利于2個(gè)長片段的融合。在每個(gè)差異核苷酸位點(diǎn)處分別設(shè)計(jì)正、反向引物。TuMV C4-VPg和TuMV CDN1-VPg氨基酸序列存在5個(gè)差異位點(diǎn)，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，分別設(shè)計(jì)5對(duì)引物，即bioC4-Ⅰ-R/F、bioC4-Ⅱ-R/F、bioC4-Ⅲ-R/F、bioC4-Ⅳ-R/F和bioC4-Ⅴ-R/F（表1），TuMV C4-VPg基因的兩端引物分別為bio120213/bio120214。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。第1輪重疊延伸PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中包括10×PCR緩沖液5 μL，0.8 mmol·L-1dNTPs 4 μL，1.0 μmol·L-1上、下游引物各 1 μL，50 ng·L-1模板 DNA 5 μL，1 U Taq 酶1 μL，ddH2O補(bǔ)齊50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。利用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，利用TIANGEN膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)長度條帶進(jìn)行切膠回收。

表1 重疊延伸PCR引物

1.3 重疊延伸PCR技術(shù)過程解析

重疊延伸PCR技術(shù)利用變異位點(diǎn)處正、反向引物以及該基因兩端引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物形成包含overlap的重疊鏈；在第2輪PCR擴(kuò)增中，通過overlap重疊鏈的延伸，可以將重疊鏈連接起來，如圖1所示。以TuMV C4-VPg質(zhì)粒為模板，進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。TuMV C4-VPg和TuMV CDN1-VPg氨基酸序列存在5個(gè)差異位點(diǎn)，將VPg基因序列分為6個(gè)片段，分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6，以 TuMV C4-VPg質(zhì)粒為模板，以 bio120213/bioC4-Ⅰ-R和 bioC4-Ⅰ-F/bio120214組合為引物，分別擴(kuò)增短片段P1和P23456。

圖1 重疊延伸PCR擴(kuò)增示意圖

利用2%瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)P1和P23456的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測鑒定，并利用TIANGEN膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶DNA，等比例混合。取上述混合DNA為模板，以bio120213/bio120214為引物，擴(kuò)增包含第1個(gè)突變位點(diǎn)的P1-23456片段。第2輪PCR反應(yīng)體系亦為50 μL，其中包括10×PCR緩 沖 液 5 μL，0.8 mmol·L-1dNTPs 4 μL，1.0 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，兩端片段PCR產(chǎn)物都調(diào)至100 ng·L-1，各取5 μL，1 U Taq酶1 μL，ddH2O補(bǔ)齊50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，50～65 ℃退火（當(dāng)兩條片段融合時(shí)，通過設(shè)置退火溫度梯度，尋找最合適的退火溫度）30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，回收的DNA片段作為目標(biāo)基因與pEASY-T1載體重組，均勻涂抹在固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h。挑取若干單菌落，重懸在1 mL液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r·min-1的搖床上搖菌4 h。取3 μL菌液為模板，以bio120213/bio120214為引物，進(jìn)行PCR鑒定?？寺≥d體過程參考全式金（北京）有限公司關(guān)于克隆載體pEASY-T1 Cloning Kit的操作指南。

2 結(jié)果與分析

2.1 TuMV CDN1-VPg與TuMV C4-VPg氨基酸差異位點(diǎn)分析

利用DNAMAN 5.0軟件對(duì)TuMV C4-VPg和TuMV CDN1-VPg氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者存在5個(gè)差異氨基酸位點(diǎn)，即第52位異亮氨酸I/亮氨酸L，二者同為非極性疏水性氨基酸；第97位谷氨酸E/賴氨酸K，前者為酸性氨基酸，后者為堿性氨基酸；第101位和第105位天冬酰胺N/天冬氨酸D，前者為極性氨基酸，后者為酸性氨基酸；第117位異亮氨酸I/纈氨酸V，二者都為非極性疏水性氨基酸（圖2）。

圖2 TuMV CDN1/C4-VPg氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.2 利用改良SOE-PCR技術(shù)定點(diǎn)突變TuMV C4-VPg-Ⅰ基因

經(jīng)過序列比對(duì)，TuMV C4-VPg與TuMV CDN1-VPg蛋白間存在5個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，在這5個(gè)差異氨基酸位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的核苷酸位點(diǎn)處，設(shè)計(jì)正、反向引物（表1），即bioC4-Ⅰ-R/F、bioC4-Ⅱ-R/F、bioC4-Ⅲ-R/F、bioC4-Ⅳ-R/F和bioC4-Ⅴ-R/F。第1輪PCR擴(kuò)增獲得P1（160 bp）和P23456（448 bp），第 2輪 PCR 擴(kuò)增獲得 P1-23456，即 C4 VPg-Ⅰ（576 bp）。兩輪PCR擴(kuò)增后，將獲得的PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)在退火溫度為53 ℃的PCR反應(yīng)體系中，可以獲得目標(biāo)片段長度的產(chǎn)物（圖3）。同時(shí)，通過梯度PCR儀，分別找到適于TuMV C4-VPg另外4個(gè)差異位點(diǎn)的退火溫度，分別為58、50、55、55 ℃。

圖3 P1、P23456以及C4 VPg-Ⅰ 目標(biāo)片段電泳檢測結(jié)果M，MarkⅠ。

第2輪PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定，采用天根膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)長度的條帶進(jìn)行切膠回收純化（由于第2輪PCR反應(yīng)中會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，所以此時(shí)不宜用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，應(yīng)該通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切取目標(biāo)長度的條帶進(jìn)行回收），純化產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌trans 5α。挑取2個(gè)陽性克隆菌液送美吉生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序檢測。通過上述方法，分別對(duì)TuMV C4/CDN1-VPg基因序列存在的5個(gè)核苷酸差異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)過Sanger測序檢測，5個(gè)突變位點(diǎn)均達(dá)到預(yù)期要求，獲得5個(gè)單點(diǎn)突變體即TuMV C4-VPg-Ⅰ、TuMV C4-VPg-Ⅱ、TuMV C4-VPg-Ⅲ、TuMV C4-VPg-Ⅳ和TuMV C4-VPg-Ⅴ（圖 4）。

圖4 5個(gè)單點(diǎn)突變體基因的測序檢測Ⅰ，TuMV C4-VPg-Ⅰ；Ⅱ，TuMV C4-VPg-Ⅱ；Ⅲ，TuMV C4-VPg-Ⅲ；Ⅳ，TuMV C4-VPg-Ⅳ；Ⅴ，TuMV C4-VPg-Ⅴ。

3 結(jié)論與討論

Rusholme等（2007）利用大白菜抗/感病親本，定位克隆了retr01與ConTR01基因，其中retr01為隱性抗病基因，ConTR01為顯性抗病基因，這2個(gè)基因分別位于R4和R8染色體上，共同控制TuMV CDN1株系；Qian等（2013）以大白菜感病材料極早春和抗病材料BP8407為親本，采用BSA法，通過篩選SSR和InDel標(biāo)記，最終定位克隆retr02基因，該基因?yàn)殡[性抗病基因，具有廣譜抗性，尤其對(duì)TuMV C4株系表現(xiàn)高度抗性。白菜類蔬菜中不同的抗病毒基因?qū)uMV不同株系的抗性也不一樣，通過探究TuMV CDN1與C4株系間的差異，可以為揭示白菜類蔬菜抗病毒基因的抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

李國亮等（2017）通過酵母雙雜交試驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明：TuMV-C4與白菜eIF（iso）4E.a可以相互作用，而與白菜eIF（iso）4E.c不能相互作用；TuMV-UK1與白菜eIF（iso）4E.c可以相互作用，而與白菜eIF（iso）4E.a不能相互作用，通過對(duì)TuMV-UK1 VPg與TuMV-C4 VPg氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者間存在4個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，且相對(duì)集中，分別是第89位（F/L）、第105位（N/D）、第 114位（P/S）和第119位（M/V）氨基酸，因此推測，某個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變化可以影響其功能的表達(dá)。重疊延伸PCR技術(shù)可以在體外定點(diǎn)突變核苷酸，制備單點(diǎn)突變體用于其功能研究，該技術(shù)已有很多報(bào)道，但其反應(yīng)體系尚待優(yōu)化。雒麗娜等（2012）采用重疊延伸PCR技術(shù)，以重組的人組織型纖溶酶原激活劑rPA基因?yàn)槟０澹晒?shí)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，為rPA基因的進(jìn)一步克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ)。孟祥平等（2013）通過優(yōu)化中間引物互補(bǔ)長度、SOE-PCR體系的模板濃度、起始模板的純度以及循環(huán)次數(shù)等條件，成功獲得特異性強(qiáng)和保真度高的BTRCP-Cyp A融合基因。

常規(guī)獲得一段DNA的方法包括限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴(kuò)增法和人工合成法等?；蚬δ艿难芯客杏谄渲械娜舾蓚€(gè)堿基變化，重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)于研究體外基因突變的功能，提供了一種有利的方法。在該技術(shù)過程中經(jīng)常出現(xiàn)擴(kuò)增條帶彌散和非特異性擴(kuò)增等情況，因此需要整理一個(gè)優(yōu)化的技術(shù)流程，來快速、準(zhǔn)確地定點(diǎn)突變基因。重疊延伸PCR依據(jù)兩條模板鏈中間的overlap進(jìn)行重疊，互為模板進(jìn)行延伸，因此overlap長度對(duì)第2輪PCR擴(kuò)增比較重要，建議中間引物長度為30 bp左右，引物過短容易出現(xiàn)擴(kuò)增條帶彌散現(xiàn)象；引物中GC含量在55%以上，有利于第2輪PCR擴(kuò)增過程中兩段DNA片段融合；第2輪PCR擴(kuò)增前，應(yīng)將第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，避免第1輪PCR擴(kuò)增過程中剩余的中間引物對(duì)第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)生影響；在第2輪PCR擴(kuò)增過程中，模板過多或過少都易產(chǎn)生彌散或非特異擴(kuò)增，應(yīng)將第1輪PCR擴(kuò)增的兩組產(chǎn)物等量混合（各取500 ng左右，50 μL擴(kuò)增體系），作為第2輪PCR擴(kuò)增的模板；另外，在第2輪PCR擴(kuò)增過程中，通過設(shè)置退火溫度梯度，可以快速找到擴(kuò)增該位點(diǎn)的適宜退火溫度，節(jié)約時(shí)間。本試驗(yàn)通過梯度PCR儀，找到適于TuMV C4-VPg 5個(gè)差異位點(diǎn)的退火溫度，分別為53、58、50、55、55 ℃。

隨著植物基因定位、克隆的不斷發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)野生型個(gè)體和突變型個(gè)體往往只在某個(gè)基因上有若干個(gè)堿基的變化，最終導(dǎo)致其表型的巨大變化，但目前植物體內(nèi)基因的定點(diǎn)突變技術(shù)受轉(zhuǎn)基因技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)的影響，推廣比較困難。重疊延伸PCR（SOE-PCR）技術(shù)是在植物體外對(duì)目標(biāo)基因定點(diǎn)突變，成本低、簡單易操作，可以高效用于驗(yàn)證目標(biāo)氨基酸位點(diǎn)的功能。隨著二代、三代高通量測序的成熟，對(duì)目標(biāo)基因上的SNP位點(diǎn)不斷深入挖掘，通過重疊延伸PCR技術(shù)，以SNP位點(diǎn)為橋梁，可以將基因定向轉(zhuǎn)化為單點(diǎn)突變體，為深入研究氨基酸位點(diǎn)的功能奠定基礎(chǔ)。

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Abstract：Turnip mosaic virus（TuMV）was an important disease for Brassica rapa L. ssp. pekinensis production，and the TuMV VPg gene had played a vital role infecting production process．While，the pathogenicity of different TuMV strains was diverse．This experiment adopted improved splicing by overlap extension PCR（SOE-PCR）technology，took TuMV-C4 VPg gene sequence as template，carried out sitedirected mutagenesis on 5 different single-nucleotides between TuMV C4-VPg and TuMV CDN1-VPg genes．The results indicated that 5 single point mutants of TuMV C4-VPg were obtained by the optimized SOE-PCR，i.e.TuMV C4-VPg-Ⅰ，TuMV C4-VPg-Ⅱ，TuMV C4-VPg-Ⅲ，TuMV C4-VPg-Ⅳ and TuMV C4-VPg-Ⅴ．

Key words：Brassica rapa L. ssp. pekinensis；Turnip mosaic virus（TuMV）；VPg gene；Splicing by overlap extension PCR（SOE-PCR）；Single point mutant

Site-directed Mutagenesis of TuMV C4-VPg Gene by Optimized Splicing by Overlap Extension PCR

LI Guo-liang，QIAN Wei，ZHANG Shu-jiang，LI Fei，ZHANG Shi-fan，ZHANG Hui，XIE Lu-lu，WU Jian，WANG Xiao-wu，SUN Ri-fei*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

李國亮，博士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：li_guo_liang@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：孫日飛，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：sunrifei@caas.cn

2017-07-11；接受日期：2017-08-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372069），“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04-03），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目