陳苗生　邱曉明

[摘要] 目的 探討Rcan2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理的相互關(guān)系。 方法 方便收集該院2012年 1 月— 2017 年 1月期間診治的炎癥性腸病20 例、增生性息肉20例、腺瘤40 例、結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織80 例，獲取標(biāo)本總RNA，q PCR測(cè)定 Rcan2 mRNA 表達(dá)水平，對(duì)Rcan2 mRNA的差異表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理信息進(jìn)行相關(guān)性分析。體外轉(zhuǎn)染Rcan2基因于結(jié)直腸癌colo320DM細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)觀察Rcan2過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。體外轉(zhuǎn)染kras突變基因（G12V）于人結(jié)直腸癌細(xì)胞中，觀察Rcan2基因的表達(dá)情況。 結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中Rcan2 mRNA表達(dá)量（2.98±0.21）明顯高于其他各組。Rcan2 mRNA的表達(dá)量與腫瘤大小密切相關(guān) （P <0.01） 。Rcan2-pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增長(zhǎng)速度慢，OD值從10上升到14，而pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增長(zhǎng)速度快，OD值從12上升到18 ，過(guò)表達(dá)kras（G12V）抑制Rcan2基因表達(dá)。Rcan2相對(duì)表達(dá)量從2.8下降到1.1。 結(jié)論 這些發(fā)現(xiàn)提示Rcan2是一個(gè)潛在的結(jié)直腸癌診斷指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] Rcan2；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；結(jié)直腸癌； mRNA

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.1；R730.23 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）08（a）-0005-03

[Abstracts] Objective This paper tries to investigate the expression of Rcan2 in colorectal cancer and its relationship with clinicopathological features. Methods Convenient selection 20 patients with inflammatory bowel disease， 20 cases of hyperplastic polyps， 40 cases of adenoma， 80 cases of colorectal cancer and adjacent normal tissues from January 2012 to January 2017 in this hospital were collected. The total RNA， the expression of Rcan2 mRNA was measured by qPCR， and the difference of Rcan2 mRNA expression was correlated with the clinicopathological information of patients with colorectal cancer. The effect of Rcan2 overexpression on tumor cell proliferation was observed by MTT assay in colorectal cancer colorectal cancer cells transfected with Rcan2 gene in vitro. In vitro transfection of kras mutant gene（G12V） in human colorectal cancer cells， the expression of Rcan2 gene was observed. Results The expression of Rcan2 mRNA in colorectal cancer tissues was （2.98±0.21）， significantly higher than that in other groups. The expression of Rcan2 mRNA was closely related to tumor size （P<0.01）. Rcan2-pcdna3.1 transfected cell growth rate was relatively slow， from 10 to 14， pcdna3.1 transfected cells grew faster， from 12 to 18， overexpression kras （G12V） inhibit expression of Rcan2 gene expression， the relative expression of Rcan2 decreased from 2.8 to 1.1. Conclusion These findings suggest that Rcan2 is a potential diagnostic indicator for colorectal cancer.

[Key words] Rcan2； q PCR； Colorectal cancer； mRNA

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響到人們生活健康[1]，由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)基因，因此了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，找到結(jié)直腸癌診斷指標(biāo)，對(duì)有效治療結(jié)直腸癌具有重要意義。Rcan2做為甲狀腺激素反應(yīng)基因率先被報(bào)道[2]，之后RCAN家族其它成員的基因功能也相繼被報(bào)道，其中包括血管生成，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增值和遷移等[3-5]，但是RCAN2在腫瘤中的表達(dá)和應(yīng)用，先前并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)Rcan2在腺瘤組織，癌旁正常組織，結(jié)直腸癌組織、增生性息肉組織、炎癥性腸病組織中的表達(dá)水平，并結(jié)合結(jié)直腸癌的臨床病理信息和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分子層面上的研究，研究該院2012年 1 月— 2017 年 1月期間收治得到80例結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中Rcan2作用以及診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集該院胃腸外科手術(shù)標(biāo)本，包括腺瘤40 例、炎癥性腸病20 例、增生性息肉20例、結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織80例。以上組織，一份用于RNA的提取，一份做病理檢查。病理分期參照第 7 版UICC/AJCC 結(jié)直腸癌 TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)直腸癌患者：年齡30～ 90 歲，中位年齡 60 歲，男46例，女 34 例，腫瘤大小 <5 cm 39例、≥5 cm 41例； 20 例高分化、31例中分化、29例低分化； 49例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31 例。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Colo320DM購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院、核酸提取試劑盒（生工），熒光定量PCR試劑盒（大連）。RCAN2 mRNA和 GAPDH mRNAqPCR 特異性擴(kuò)增引物。MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，Rcan2-Pcdan3.1，krasG12V-pcdna3.1

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Colo320DM細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中， 10%胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)。將細(xì)胞接種于6孔板中，分為2組：轉(zhuǎn)染空載組；轉(zhuǎn)染krasG12V-pcdna3.1組。待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，按照試劑說(shuō)明，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出提取mRNA。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 將兩組coloDM320細(xì)胞株，轉(zhuǎn)入空載Pcdna3.1的對(duì)照組和轉(zhuǎn)入 Rcan2-Pcdna3.1的陽(yáng)性克隆組分別培養(yǎng)，按試劑說(shuō)明收集細(xì)胞，將細(xì)胞接種于 96 孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8～24 h。去上清，加入新鮮培養(yǎng)基，MTT 溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。之后去除 MTT，并向每孔加入結(jié)晶溶解液，將 96 孔培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀中，在 490 nm 處檢測(cè)各孔細(xì)胞的吸光值。以時(shí)間為橫軸，吸光值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 模板為組織cDNA，GAPDH 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物Rcan2基因，上游： 5'- CTGAGTCCACCCCAAGTGTC-3'，下游：5'- GGACGCCGAGTTTG GATGAT -3'； 內(nèi)參 GAPDH，上游： 5'-GTCAACGGATTT GGTCTGTATT -3'，下游： 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAG TGAT -3'。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，56℃ 退火加延伸 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。記錄反應(yīng)的 Ct 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

此次研究中所涉及的數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，并采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rcan2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)

為了研究Rcan2在個(gè)組織中的表達(dá)情況，該研究收集了炎癥性腸病20 例、增生性息肉20例、腺瘤40 例、結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織80例，獲取樣本總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR測(cè)定 Rcan2 mRNA的表達(dá)水平，根據(jù)各組均值做統(tǒng)計(jì)分析。如圖1所示，與癌旁正常組織相比，直腸癌組織中Rcan2成高表達(dá)（P<0.01）。而在炎癥性腸病、腺瘤、增生性息肉、癌旁正常組織中，Rcan2表達(dá)較低，且表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)直腸癌組織中Rcan2mRN4表達(dá)量（2.98±0.21）明顯高于其他各組（圖1）。

2.2 RCNA2 mRNA表達(dá)量與結(jié)直腸癌標(biāo)本臨床病理特征的關(guān)系

如表1 顯示，腫瘤大小與結(jié)直腸癌組織中Rcan2 mRNA表達(dá)量顯著相關(guān)（ P<0.01）。Rcan2 mRNA的表達(dá)量與年齡、性別、分化程度、淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)（P>0.05）。

2.3 Rcan2過(guò)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增值

為了確定Rcan2對(duì)腫瘤細(xì)胞增值的影響，該研究將Rcan2-pcdna3.1，空載轉(zhuǎn)入colo320DM細(xì)胞，培養(yǎng)72 h觀察。MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，如圖2所示，與空載轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Rcan2-pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，這意味著過(guò)表達(dá)Rcan2對(duì)對(duì)細(xì)胞的增殖能力起到抑制作用。Rcan2-pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增長(zhǎng)速度慢，OD值從10上升到14，而pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增長(zhǎng)速度快，OD值從12上升到18 ，過(guò)表達(dá)kras（G12V）抑制Rcan2基因表達(dá)。Rcan2相對(duì)表達(dá)量從2.8下降到1.1。

2.4 kras突變抑制Rcan2基因表達(dá)

大約40%的結(jié)直腸癌存在kras基因的突變，為了解kras突變對(duì)Rcan2表達(dá)量的影響，該研究將krasG12V-pcdna3.1與空載pcdna3.1分別轉(zhuǎn)染colo320DM細(xì)胞。培養(yǎng)48 h，提取總RNA。熒光定量pcr檢測(cè)Rcan2 mRNA表達(dá)量。如圖4所示，與轉(zhuǎn)染krasG12V-pcdna3.1組相比，空載組Rcan2表達(dá)量更高（P<0.01），這表明突變kras抑制Rcan2基因表達(dá)。

3 討論

在中國(guó)結(jié)直腸癌作為高危癌種，大約有4%～5%的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而大約又有1/3的結(jié)直腸癌患者死于該疾病[6]。結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前已有相關(guān)的基因途徑被報(bào)道。譬如Wnt-APC通入， Ras-MAPK通路等[7]，mTORC1作為一個(gè)重要的蛋白激酶，也與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近期又有相關(guān)研究[8-9]報(bào)道了Rcan家族與細(xì)胞的增值相關(guān)，之后研究又報(bào)告了Rcan1在腎癌和卵巢癌中血管表達(dá)，該研究近期發(fā)現(xiàn)家族的另一個(gè)成員Rcan2在結(jié)直腸癌的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著，通過(guò)熒光定量 PCR 檢測(cè) Rcan2mRNA在結(jié)直腸癌，增生性息肉、腺瘤、炎癥性腸病及癌旁正常組織中的表達(dá)，該研究發(fā)現(xiàn)Rcan2的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)且明顯高于其他各組。這暗示Rcan2的高表達(dá)是結(jié)直腸癌的特征之一。此外，該研究又結(jié)合臨床病理分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的 Rcan2 mRNA 意味著更小體積的腫瘤，隨后的MTT的結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了上訴的推論。這些結(jié)果表明Rcan2 抑制腫瘤的增值。endprint

西妥昔單抗和帕尼單抗作為表皮生長(zhǎng)因子受體抗體藥物，用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，EGFR作為跨膜酪氨酸激酶受體家族成員，激活RAS-Raf-MAP激酶通路，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖在RAS-Raf-MAP激酶通路中KRAS突變已被報(bào)道在是抗EGFR抗體治療的一個(gè)重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)，因此了解kras的狀態(tài)與下游分子的相互關(guān)系對(duì)靶向藥物的治療尤為重要，該次研究發(fā)現(xiàn)將kras轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞colo320DM，Rcan2的表達(dá)量下調(diào)，這是否意味著Rcan2參與了耐藥機(jī)制，或者說(shuō)Rcan2可能作為潛在的治療靶點(diǎn)這值得進(jìn)一步研究[10-11]。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，Rcan2在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，Rcan2的高表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增值，并與腫瘤大小密切相關(guān)，此外，進(jìn)一步研究證實(shí)KRAS突變與Rcan2相互關(guān)系，揭示了Rcan2可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-05-08）endprint