李興安 牛慶生 薛運波

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108）

蜜蜂屬生物的物種分子診斷標(biāo)簽：動物DNA條形碼

李興安 牛慶生 薛運波

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108）

蜜蜂屬生物構(gòu)成了膜翅目昆蟲一個代表屬，蜜蜂屬生物的物種分子診斷標(biāo)簽普遍選用動物DNA條形碼；蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼經(jīng)過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，成為動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫一組不可或缺的生物樣本分類學(xué)資源。本文從如下三個方面綜述了蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼研究進(jìn)展，即蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼含義，蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法，以及蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼分類學(xué)地位。

蜜蜂屬生物；動物DNA條形碼

Amot等（1993）在從事鐮狀瘧原蟲孢子體分泌蛋白質(zhì)（circumsporozoite，一種保守蛋白質(zhì)或管家蛋白質(zhì)）基因多態(tài)性研究中，從基因組提取物中發(fā)現(xiàn)了一組可變串聯(lián)重復(fù)DNA序列，并將其命名為DNA條形碼（DNA barcode）[1]。Folmer等 (1994)通過比對棘皮動物等動物界11個水生無脊椎動物門的線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基-1（cytochrome oxidase subunitⅠgene，CO-Ⅰ）基因座等位基因，認(rèn)為CO-Ⅰ基因近5′端、長度約710堿基對的一個DNA片段可以區(qū)別所有待測樣本[2]。該DNA標(biāo)記在相同研究領(lǐng)域的一些后續(xù)文獻(xiàn)中被形象地命名為 CO-Ⅰ基因“Folmer”片段（或 5′端“Folmer”片段，或“Folmer”片段）。Saccone等（1999）通過分析后口動物線粒體基因組組成，認(rèn)為線粒體基因組編碼區(qū)（占據(jù)線粒體基因組絕大多數(shù)序列份額）的主要變異形式是堿基置換，這種變異僅改變DNA堿基序列秩序而不改變DNA序列長度；而線粒體基因組非編碼區(qū)（占據(jù)線粒體基因組極少數(shù)序列份額）的主要變異形式是堿基缺失和插入（線粒體基因組變異的另外一種形式），這種變異既改變DNA堿基序列秩序又改變DNA序列長度[3]。基于此，不同動物物種的線粒體基因組被限制于相對狹窄的長度波動范圍，例如，多數(shù)動物物種的線粒體基因組長度約為16 K至17 K堿基對。Hebert等（2003）依據(jù)“Folmer”片段單核苷酸多態(tài)性譜圖，先后鑒定了鱗翅目200多個近緣物種[4]。多數(shù)作者認(rèn)為，Hebert等最先使用了動物DNA條形碼（animal DNA barcode）這個表述；鑒于Hebert等的出色工作，多數(shù)文獻(xiàn)追捧“Folmer”片段為標(biāo)準(zhǔn)動物DNA條形碼。

此后短短十多年里，在“國際生物DNA條型碼發(fā)展計劃”推動下，諸多國家相繼建立了哺乳動物綱、硬骨魚綱、鳥綱、昆蟲綱等動物物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫；其中，昆蟲綱35個目、近8萬個物種兌現(xiàn)了各自特有的DNA條形碼[5]。近幾年來，伴隨高通量基因組測序平臺開發(fā)、大規(guī)模DNA平行測序數(shù)據(jù)解析以及宏基因組學(xué)篩選方法嘗試等二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，動物DNA條形碼或動物DNA條形碼測定（barcoding）被賦予了新的含義，即DNA小條形碼（DNA mini-barcode）或宏 DNA 條形碼測定（meta-barcoding）[6]。

毫無疑問，蜜蜂屬生物構(gòu)成了膜翅目昆蟲一個代表屬，蜜蜂屬生物的物種分子診斷標(biāo)簽普遍選用動物DNA條形碼；蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼經(jīng)過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，成為動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫一組不可或缺的生物分類學(xué)資源。那么，蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼含義、物種DNA條形碼生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法以及物種DNA條形碼分類學(xué)地位分別是什么呢？本文綜述了這個方向的研究進(jìn)展。

1 蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼含義

蜜蜂屬生物的物種分子診斷標(biāo)簽為什么采用動物DNA條形碼這個DNA標(biāo)記呢？在理論上，動物DNA條形碼具有眾多后口動物CO-Ⅰ基因相應(yīng)序列的所有結(jié)構(gòu)特征：首先，變異形式主要是堿基置換，堿基置換產(chǎn)生單核苷酸變異；其次，堿基序列越是靠近5ˊ端，其單核苷酸變異數(shù)量占總堿基變異數(shù)量的比例越大；最后，在線粒體35個編碼基因或基因片段涉及的單核苷酸變異中，動物DNA條形碼涉及的單核苷酸變異程度最大（或最為豐富）[3]。就實驗技術(shù)而言，動物DNA條形碼側(cè)翼序列極端保守，PCR實驗不需要嚴(yán)格的設(shè)置條件，這非常有利于PCR特異性擴增目標(biāo)產(chǎn)物。

不僅如此，動物DNA條形碼尚有一段DNA序列，其位置位于CO-Ⅰ基因近5′端，其長度約130堿基對[7]。一些學(xué)者甚至認(rèn)為，這個DNA標(biāo)記的物種鑒定分辨率毫不遜色于標(biāo)準(zhǔn)動物DNA條形碼的物種鑒定分辨率。在基于文庫構(gòu)建的二代測序技術(shù)路線中，該DNA標(biāo)記有效地解決了PCR擴增DNA序列的技術(shù)瓶頸：第一，短DNA片段在PCR擴增過程中趨向于不形成非特異擴增產(chǎn)物；第二，陳舊型生物樣本基因組存在不同程度DNA降解，不規(guī)范DNA提取操作極易導(dǎo)致DNA片段化，它們均不利于PCR擴增完整DNA序列；第三，堿基插入、缺失突變?nèi)菀讓?dǎo)致CO-Ⅰ基因移碼，這通常導(dǎo)致PCR擴增DNA序列效率下降。在蜜蜂屬生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中，多數(shù)DNA條形碼長度為691堿基對，而小蜜蜂的DNA條形碼長度僅為489堿基對（表1）。這很有可能說明小蜜蜂的DNA條形碼是標(biāo)準(zhǔn)動物DNA條形碼的一部分。

表1 蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼長度值統(tǒng)計表

2 蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法

蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼涉及了哪些生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法？在物種DNA條形碼基因分型研究的發(fā)展動態(tài)中，相似序列系統(tǒng)發(fā)生樹重建和序列差異距離測算是最常用的兩種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法。在基于鄰位相連算法構(gòu)建的同屬物種系統(tǒng)發(fā)生樹樹形結(jié)構(gòu)中，1個動物DNA條形碼能否成為物種分子診斷標(biāo)簽，取決于待測數(shù)據(jù)能否被聚類為一個完全（甚至于部分）獨立的進(jìn)化分枝；在基于K2P遺傳距離計算模塊比較的遺傳距離差異矩陣中，1個動物DNA條形碼能否成為物種分子診斷標(biāo)簽，取決于遺傳距離測算值是否同時分布于種內(nèi)同質(zhì)性差異閾值規(guī)定范圍和種間異質(zhì)性差異閾值規(guī)定范圍[5]。

目前，伴隨動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量的海量增長，蜜蜂屬生物的物種鑒定工作高度依賴于動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。在基于BLAST搜索引擎檢索的候選DNA條形碼數(shù)據(jù)列表中，1個動物DNA條形碼能否成為物種分子診斷標(biāo)簽，取決于鑒定參數(shù)設(shè)置水平和候選DNA條形碼檢索數(shù)量[8]。

3 蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼分類學(xué)地位

蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼具有哪些動物分類學(xué)貢獻(xiàn)？動物形態(tài)和動物DNA條形碼是動物分類學(xué)為明確動物類型學(xué)物種（typological species）經(jīng)常使用的兩個關(guān)鍵詞。而且，比之于動物形態(tài)學(xué)針對連續(xù)型計量資料以反映動物群體的性狀表現(xiàn)型，動物DNA條形碼測定針對離散型計量資料以表征動物群體的線粒體基因組單倍型。鑒于動物DNA條形碼能夠鑒別98%以上動物物種，一個動物物種在采用傳統(tǒng)的形態(tài)聚類簇（morphocluster）表述甚至于形態(tài)物種（morphospecies）表述的同時，也可以采用現(xiàn)代的物種DNA條形碼聚類簇（barcodecluster）表述或者DNA條形碼目錄物種（barcode for tracking species）表述。

然而，絕大多數(shù)DNA條形碼顯示的物種鑒定錯誤率小于5%[9]。這說明，如同形態(tài)變異分析方法，DNA條形碼測定技術(shù)也存在局限性。事實上，動物DNA條形碼的物種鑒別力取決于動物DNA條形碼的單核苷酸變異分布和數(shù)量。對于不同屬以下物種，DNA條形碼的物種鑒別力不等同，種間遺傳多樣性豐富程度是影響DNA條形碼鑒別力的主要因素[5]。例如，相對于熊蜂屬160多個物種DNA條形碼，蜜蜂屬僅有8個物種DNA條形碼（圖1）。顯然，熊蜂屬生物的物種DNA條形碼鑒定錯誤率可能要遠(yuǎn)大于蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼鑒定錯誤率。而且，有趣的是，迄今為止，昆蟲形態(tài)變異分析將蜜蜂屬生物劃分為9至12個物種，而動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫僅收錄了蜜蜂屬8個物種DNA條形碼。那么，是動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫無意“漏掉了”黑大蜜蜂的DNA條形碼數(shù)據(jù)記錄，還是有意排除了相應(yīng)的數(shù)據(jù)記錄？我們該如何解釋這個事實？

圖1 蜜蜂屬生物的物種DNA條形碼示范性“條形圖”

最近發(fā)表于“Insect Science”（中國科學(xué)院雙月期刊）的一篇論文有助于回答這個問題[10]。那就是，對于絕大多數(shù)動物物種，形態(tài)學(xué)分析結(jié)果與DNA條形碼測定結(jié)果是一致的，因此，一個動物DNA條形碼就應(yīng)該對應(yīng)一個動物物種；而對于個別動物物種，形態(tài)學(xué)分析結(jié)果與DNA條形碼測定結(jié)果可能不一致，它們就類似一個硬幣的正反面，不能夠過分強調(diào)一面而完全忽視另一面，不能夠簡單地理解為“一種動物，一個DNA條形碼”，還需要補充必要的動物形態(tài)學(xué)分析數(shù)據(jù)。

[1]Arnot DE,Roper C,Bayoumi RA.Digital codes from hypervariable tandemly repeated DNA sequences in the Plasmodium falciparum circumsporozoite gene can genetically barcode isolates[J].Mol Biochem Parasitol,1993,61(1):15-24.

[2]Folmer O,Black M,Hoeh W,et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates [J].Mol Mar Biol Biotechnol,1994,3(5):294-299.

[3]Saccone C,Giorgi C D,Gissi C,et al.Evolutionary genomics in Metazoa:the mitochondrial DNA as a model system[J].Gene,1999,238(1):195-209.

[4]Hebert PD,Cywinska A,Ball SL,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci,2003,270(1512):313-321.

[5]Jinbo U，Kato T，Ito M.Current progress in DNA barcoding and future implications for entomology[J].Entomological Science,2011,14(2):107-124.

[6]Brandon-Mong GJ,Gan HM,Sing KW,et al.DNA metabarcoding of insects and allies:an evaluation of primers and pipelines[J].Bulletin of Entomological Research,2015,105(6):717-727.

[7]Meusnier I,Singer G AC,Landry JF,et al.A universal DNA mini-barcode for biodiversity analysis[J].BMC Genomics,2008,9(1):214.

[8]Chakraborty M,Dhar B,Ghosh SK.Design of character-based DNA barcode motif for species identification:A computational approach and its validation in fishes[J].Mol Ecol Resour.,2017(doi:10.1111/1755-0998.12671)[Epub ahead of print].

[9]Fiser Pecnikar Z,Buzan EV.20 years since the introduction of DNA barcoding:from theory to application[J].J Appl Genet,2014,55(1):43-52.

[10]Stepanovic S,Kosovac A,Krstic O,et al.Morphology versus DNA barcoding:two sides of the same coin.A case study of Ceutorhynchus erysimi and C.contractus identification [J].Insect Sci.,2016,23(4):638-648.

Review on animal DNA barcode serving as a diagnostic character of molecular species belonging to Genus Apis

Li Xing’an,Niu Qingsheng,Xue Yunbo
(Jilin Provincial Institute of Apicultural Science,Jilin 132108)

Bees,Genus Apis,is special representative among Order Hymenoptera.Identification of their species has been carried out by animal DNA barcode as a diagnostic molecular character.After generated through bioinformatics,the indespensible datasets of bee DNA barcodes are integrated into the data repository of animal DNA barcodes for any forms of sampling taxonomy.Here,threes aspects on bee DNA barcodes are reviewed,including definition in bee DNA barcodes,generation of bee DNA barcodes through bioinformatics and promise of DNA barcode for taxonomy.

Genus Apis;animal DNA barcode

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20150623024TC；20160623015TC）；國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-45-KXJ2；CA2S-45-SYZ4）

李興安（1965-），男，研究員，E-mail:Lxingan@sina.com