許意 孫明港 楊世玉 陳云飛 陳紫珺 陶偉

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院，合肥230036）

一種蝸牛提取物對花粉破壁方法的研究

許意 孫明港 楊世玉 陳云飛 陳紫珺 陶偉

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院，合肥230036）

成果背景：花粉里含有豐富的營養(yǎng)成分，被稱之“植物微型營養(yǎng)庫”，但因花粉壁的特殊結(jié)構(gòu)，物理、化學(xué)及生物三類七種方法均難以進(jìn)行破壁，影響了開發(fā)利用，即使加溫至300℃，也難以使花粉釋放出營養(yǎng)成分。方法：本項(xiàng)目受蝸牛于下雨天活動(dòng)并對植物葉子進(jìn)行蠶食的啟發(fā)，捕捉蝸牛經(jīng)超低溫（-45℃）冷凍粉碎，加磷酸鹽（pH 6.5,0.05 mol）緩沖液提取，離心去沉淀物，取清液，調(diào)pH至5.6后，沸水保溫至渾濁即流水冷卻至常溫再離心，放冰箱存放待用；取廚房所收集廢蛋殼加1%NaCl溶液提取，依前述提取蝸牛提取物方法制蛋殼蛋清提取物，放冰箱保存;取沉淀物與前沉淀物作飼料?；ǚ塾?∶1之比例加生理鹽水浸提溫潤后，分別加入前者兩個(gè)動(dòng)物提取物破壁，殺菌攪拌，完成破壁滅菌。結(jié)果：反應(yīng)30分鐘后顯微鏡和電鏡觀察表明，破壁率為97%以上，外表呈明顯孔洞或裂溝，紫外分析表明260 nm、280 nm波長吸收值均比破壁前提高30%以上；鏡檢反應(yīng)液含菌數(shù)<10個(gè)（以大腸桿菌數(shù)計(jì)，每ml數(shù)）反應(yīng)系統(tǒng)混合物進(jìn)行固液分離，用于食品加工或制作保健品。

花粉破壁；蝸牛提取物；蛋殼蛋清提取物；瞬時(shí)沸水變性處理；固液離心分離

花粉（pollen）含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對人體具有較好的增強(qiáng)免疫力和耐力、抗疲勞，在臨床醫(yī)療上是治療前列腺炎的一劑良藥，因而被人們稱作植物類的“微型營養(yǎng)庫”，能提供生命的活力。它的粉壁上包含著由胡蘿卜素和類胡蘿卜素酯的氧化聚合物（即花粉素）能抗酸、堿、鹽及酶學(xué)水解，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，妨礙了人們對它的內(nèi)含物在食品和醫(yī)藥上的開發(fā)應(yīng)用。為了有效地提取花粉內(nèi)的目標(biāo)產(chǎn)物，目前國內(nèi)外對花粉破壁研究出物理類（機(jī)械磨碎、滲透壓差、變溫、超聲波、氣流）、化學(xué)類（有機(jī)溶劑脫壁）、生物類（微生物發(fā)酵、蜂糧溫育）等七種破壁方法[3,4]，取得了一定成果。本項(xiàng)目研究者還曾獲得國家發(fā)明獎(jiǎng)[3,4]。但是因花粉來自不同植物，花粉壁結(jié)構(gòu)差異較大，多種破壁方法對不同花粉的外壁的破壁效果均存在較大差異，一般均在50%左右。欲達(dá)到較好破壁效果，需要二種以上的方法組合。不僅耗能大，且存在二次污染。因此花粉加工的產(chǎn)業(yè)化始終難以形成。本項(xiàng)目研究者采取下雨天氣從草叢、蔬菜葉子上采集蝸牛，經(jīng)-45℃低溫冰凍搗碎后再用生理鹽水快速勻漿提取蝸牛軀體內(nèi)液，于4000 r/min離心取清液放冰箱待用;然后加入潤濕的花粉漿中，攪拌5～10分鐘破壁，顯微鏡觀察并測定破壁效果，蝸牛漿液及蛋殼的提取物的沉淀經(jīng)干燥作為家禽飼料。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料：蝸牛采集于草叢；花粉購自養(yǎng)蜂場；蝸牛破壁成分的提取媒介：生理鹽水;

1.1.2 主要器械：工業(yè)離心機(jī)；紫外分析儀；攪拌器（日本）；水浴鍋；板框過濾機(jī)（1t/h）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝸牛破壁液的制備。利用下雨天氣，去菜園或路邊草叢采集（捕獲）蝸牛洗凈即放在-45℃以下的冰箱中冷凍48 h，搗碎呈糊狀后，按重量比1∶10加入經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水充分?jǐn)嚢韬螅?20目的尼龍紗布過濾，取濾液即用10%醋酸（以下簡稱HAc）調(diào)pH 5.6,濾渣曬干作飼料，前者于沸水中在攪拌下保溫3～5 min(或有)混濁出現(xiàn)時(shí)，立即于流水下驟冷至常溫，于8000 r離心15 min，取上層清液放冰箱保存待用，沉淀物與前濾渣併合作飼料。

1.2.2 蛋殼殺菌劑的制備：與餐飲店約定收集或購已被使用的廢雞蛋殼。依“1.2.1”類似方法，制備對已破壁的花粉液滅菌，（再于37℃水浴，保溫30 min），對花粉糊殺菌消毒。

1.2.3 破壁及滅菌：取花粉，蝸牛破壁液，殺菌消毒劑，依1∶0.10∶0.10的比例，配制反應(yīng)系統(tǒng)成糊，快速反應(yīng)10～15 min。板框過濾機(jī)過濾或240目尼龍布袋吊濾，取濾液依1%加入吐溫-20靜置沉淀?；ǚ燮票诤蟮臍堄辔锝?jīng)干燥后用于制面條、餅干、面包。

1.2.4 花粉破壁效果的檢測

(1)花粉破壁后反應(yīng)液檢測及破壁率：上述反應(yīng)液以3000 r/min離心10 min，取清液1ml，加生理鹽水3ml，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，于260及280 nm測定紫外光吸收值[5]。

(2)顯微鏡觀察破壁花粉表面形態(tài)變化：用接種針分別蘸取花粉破壁沉淀物于載玻片上，滴少量水勻開，蓋上蓋玻片，以 10×40、10×60 和 10×100 放大倍率于顯微鏡下觀察。再與對照樣品比較，分別統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野，計(jì)算破壁率。

(3)電鏡掃描觀察:將破壁后的花粉用4%戊二醛（國產(chǎn)品）及多聚甲醛固定一周，然后用Tris緩沖液(pH 6.5)洗滌，乙醇梯度無水乙醇脫水后，即醋酸異戊酯脫水，真空干燥，噴金。送入掃描電鏡于6000倍觀察花粉破壁狀態(tài)。

2 結(jié)果分析

2.1 花粉破壁前后液對紫外光吸收比較

蝸牛提取液對花粉破壁后，花粉粒內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸等大分子物質(zhì)通過被水解的孔道釋放出來，對紫外光260、280 nm處的有明顯吸收，未破壁者雖然也有吸收，但僅有小分子RNA吸收釋放，而諸如大分子DNA來說，卻難以排出并吸收特征波長的紫外光（表1）。

表1 花粉被蝸牛細(xì)胞提取物破壁后紫外光吸收的變化

紫外吸收分析表明，蛋白質(zhì)與核酸是花粉中主要的生物化學(xué)成份，其中蛋白質(zhì)約占細(xì)胞內(nèi)含物的20～25%之間，核酸含量一般在32～1695 mg/100g之間。自然界中核酸的含量在1000 mg/100g，即相當(dāng)于1%以上核酸的花粉約占一半以上。在蝸牛提取物作用下，花粉破壁面積大。破壁程度較方法(1)效率高，破損面積大，在于蝸牛消化道內(nèi)含多種水解酶，不僅有能水解纖維素、肽聚糖和幾丁質(zhì)類的酶，而且含水解木質(zhì)纖維素類酶等，水解物范圍寬。從而能使花粉粒內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過花粉壁較大破損處而被釋放出來。盡管這些大分子的空間結(jié)構(gòu)未改變，但造成花粉壁內(nèi)外環(huán)境大分子分布狀態(tài)的改變，使花粉壁外環(huán)境中的大分子吸收紫外光的量也增加。這一結(jié)果不僅表明了蝸牛組織提取物對花粉壁有多種水解酶，而且含水解花粉壁酶活性也高，使花粉破壁后對紫外光吸收值增加了30%以上，提高了對花粉的破壁效果，資源利用率和節(jié)能減排的利弊優(yōu)于其他方法。

2.2 顯微鏡對花粉破壁外觀變化狀態(tài)的觀察效果也優(yōu)于對照組

圖1 未破壁花粉電子顯微鏡照片（6000倍）

圖2 破壁花粉的彗星電泳（動(dòng)態(tài)激光散射圖）

圖3 大白菜花粉（6000倍）

圖4 南瓜花粉（6000倍）

圖5 蘿卜花粉（6000倍）

通過顯微鏡鏡頭觀察，發(fā)現(xiàn)花粉粒經(jīng)蝸牛復(fù)合酶系提取物處理后幾乎無完整花粉粒存在，用血球計(jì)數(shù)器任意抽取5個(gè)以上的視野分別計(jì)算未破壁和破壁數(shù)，破壁率均為100%。圖1和圖2分別為破壁花粉不同視野中的破壁狀況。圖中表明可以清楚地觀察到花粉破壁前的狀態(tài)，細(xì)胞壁幾乎完好無損；圖2是破壁花粉的彗星電泳（動(dòng)態(tài)激光散射圖）照片，從照片中可以看到，破壁花粉壁上有明顯裂痕和缺損孔道，同時(shí)，伴隨有細(xì)胞內(nèi)含物的溢出破壁效果明顯。

2.3 蝸牛破壁提取物破花粉壁方法的實(shí)用性

圖6 破壁豌豆花粉（6000倍）

圖7 破壁杜鵑花粉（6000倍）

圖8 破壁蘿卜花粉（6000倍）

圖9 破壁花粉混合樣

圖10 花粉破壁前的花粉管

圖3～圖5分別掃描放大6000倍所采大白菜、南瓜、蘿卜花粉的電子顯微鏡照片。從照片上（圖6～圖9）可以觀察到，細(xì)胞外壁上都出現(xiàn)了破壁的裂痕并伴隨內(nèi)含物的溢出，表明蝸牛破花粉壁的方法對各類花粉均適用。圖中清楚顯示每類花粉粒破壁位置不同，所表現(xiàn)不同酶水解位置和孔隙大小不同，而且各位點(diǎn)的水解底物分布不同，這可能不僅取決于同一酶在花粉壁表明同一物質(zhì)分布不同，而且不同酶在不同花粉壁上選擇于相似點(diǎn)，但成分可能不同。

3 討論

3.1 花粉破壁方法的選擇與花粉壁的組成成分相關(guān)

（1）花粉壁的結(jié)構(gòu)組成：花粉是顯花植物雄蕊花粉囊內(nèi)的活性粉狀物，在一定環(huán)境條件下可被培養(yǎng)成單倍體植株，內(nèi)含豐富的營養(yǎng)成分?；ǚ郾谟蓛?nèi)外二層壁構(gòu)成。外層壁較厚而硬，缺乏彈性，主要成分為花粉素，其次是幾丁質(zhì)、果膠質(zhì)、纖維素和半纖維素等。萌發(fā)孔和溝縫是外壁較薄的區(qū)域，是花粉管生長并伸出之處（見圖8）。諾克斯等認(rèn)為花粉素是胡蘿卜素和類胡蘿卜素酯的氧化聚合物，這種有機(jī)化合物組成極為復(fù)雜，依作者多年對不同花粉的研究和開發(fā)利用，認(rèn)為這類化合物不僅極穩(wěn)定并難氧化，而且對酸、堿、鹽及酶的作用均為穩(wěn)定，即使在300℃以上的高溫也難以被裂解破壞[1]，花粉壁的內(nèi)層較薄，軟而有彈性，而在花粉孔處的內(nèi)壁也常硬厚，其主要成分為木質(zhì)纖維素、果膠質(zhì)、幾丁質(zhì)、半纖維、蛋白質(zhì)及少量肽聚糖等。最近課題組已研究出針對花粉壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的破壁復(fù)合酶系，現(xiàn)已付之應(yīng)用(另作報(bào)道）。

（2）花粉壁中酶系的組成：組成花粉粒內(nèi)外壁的成分與植物細(xì)胞內(nèi)外壁不同，其中最大區(qū)別即不僅含有傳遞生物信息的活性酶類，而且內(nèi)外壁的蛋白質(zhì)性質(zhì)來源和功能也完全不同，如轉(zhuǎn)化酶、核糖核酸酶、酸性碳酸酶等只存在于花粉內(nèi)壁，而脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶和蛋白酶類只分布于花粉的外壁。這些活性蛋白質(zhì)若無外界條件的誘發(fā)激活時(shí)，則不能使花粉壁水解。因此，花粉壁的這些固有特性不僅影響人們對花粉營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，而且也限制了工業(yè)上對花粉粒內(nèi)營養(yǎng)成分的提取利用，從而束縛了花粉的深層次開發(fā)[7,8]。

表2 蝸牛提取物破花粉壁與物理化學(xué)方法比較

3.2 蝸牛提取物破花粉壁的機(jī)制分析

蝸牛破花粉壁的提取物是一種以嗜草軟體動(dòng)物體液作分散相，生理鹽水作提取介質(zhì)的膠體液，其中水分占92%，蛋白質(zhì)約占5%，礦物質(zhì)為2%，所含礦物質(zhì)為氯化鈉和ZnSO4、Ca(HCO3)2等。有機(jī)物主要是構(gòu)成各類酶蛋白質(zhì)，蝸牛提取物是水解花粉壁相關(guān)酶（如纖維素復(fù)合酶、木質(zhì)纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、果膠酶等），滅菌劑原料為蛋殼膜上的溶菌酶，對來自蝸牛及原材料中真菌有較好的殺害作用，保障花粉破壁液衛(wèi)生安全性，約占破壁復(fù)合酶系介質(zhì)1.5%。

利用蝸牛消化系統(tǒng)提取能水解花粉壁的復(fù)合酶系是基于花粉是綠色植物體內(nèi)合成的物質(zhì)。盡管花粉壁有不同，但同一株植物其他組織細(xì)胞有各自特有組分，它也是由細(xì)胞中相關(guān)酶合成的。一旦花粉不能授精形成種子，而自我消亡再分解，所分解出的小分子化合物可重新利用。后者的分解也是酶的作用。因此，可以推想這些分解的酶類也存在于自然界。如作者用溶菌酶在有鈣離子存在的狀態(tài)下，可以較好的水解油菜類及十字花科類的花粉壁及向日葵花粉的溝，這樣即可判別此油菜花粉壁上存在肽聚糖結(jié)構(gòu)，發(fā)明了蛋殼蛋清提取物可對含肽聚糖的南瓜、油菜、黃瓜等植物的花粉，并于1989年獲得國家發(fā)明獎(jiǎng)。因此，使文中作者發(fā)現(xiàn)食草蝸牛組織液可用于破花粉壁，再以蛋殼提取物在對花粉破壁反應(yīng)系統(tǒng)滅菌并強(qiáng)化花粉破壁的過程，拓展了花粉破壁效果。

3.3 蝸牛對花粉破壁與其他同類花粉破壁方法的比較

本法與當(dāng)前國內(nèi)外對花粉破壁方法相比，具有的優(yōu)越性與其他方法比較如（表2）。

4 結(jié)論

蝸牛是食植物葉莖軟體動(dòng)物，對多種植物性材料有水解性，對花粉水解可行，較其他方法、材料來源廣泛，技術(shù)設(shè)施及方案設(shè)計(jì)與同類方法比較，采集簡便，可養(yǎng)殖，提取過程簡單，效率高，規(guī)模不受限制；蛋殼、蛋清抗菌安全衛(wèi)生，無廢棄物，方法科學(xué)性好；全過程資源能充分利用不產(chǎn)生污染，耗能小，投資少，可推廣，并能形成產(chǎn)業(yè)鏈，能又快又好地發(fā)展鄉(xiāng)鎮(zhèn)經(jīng)濟(jì)，優(yōu)化養(yǎng)蜂業(yè)和家禽養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，有利于農(nóng)林閑散勞動(dòng)力就業(yè)，對發(fā)展花粉加工產(chǎn)業(yè)、促進(jìn)農(nóng)民閑散勞力創(chuàng)業(yè)和增加農(nóng)民收入具有重要意義。

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Study on cytology of pollen-wall broken by a snail in the extracts

Xu Yi,Sun Minggang,Yang Shiyu,Chen Yunfei,Chen Zijun，Tao Wei
(Anhui agricultural university,school of forestry and landscape,Hefei 230036,China)

【Achievement'Background】The pollen is rich in nutrition so that it is called the"miniature plants'nutrition library",but because of the special structure of pollen wall,seven methods from physical,chemical and biolo-gical are difficult to break the wall thoroughly.It has effects important development and actual utilization.Even if it is heated to 300℃,nutrition is difficult to release from pollen.【Methods】The natural phenomenon that snails eat plants during the rainy days inspired us to raise a new way of dissolving the cell wall.In this project,first,we will reduce snails into particle sizes through cryogenic grinding at a temperature of minus 45°C and mix it with buffer solution(phosphate solution pH6.5,0.05mol)to meet the extract requirements.Then,we will get the clear supernatant by removing the precipitate through centrifugation,and we should adjust the pH of clear supernatant into 5.6.After that,we keep the solution in boiling water(100°C)until it gets turbid.Then,separate the liquid by centrifuge again after it restores normal temperature under the flowing water.Finally,We save it into the firdge to use.We can also use the mixture of eggshell and Na－Cl solution(1%)as materials to get the eggshell extract in the same way.After all these procedures,keep these two solutions refrigerated.Now,we can start the procedures of dissolving the cell wall.First,soak the pollen in the mixture of 1 part pollen solution and 1 part normal saline solution.Then,add snail extract and the eggshell extract in the part pollen solution and 1 part normal saline solution.Then,add snail extract and the eggshell extract in the pollen solution and 1 part normalsaline solution.Then,add snail extract and the eggshell extract in break between these two operations.Mix and sterilize the solution,and finally,we can get the job done.【Results】the results showed that after 30 min of reaction microscope and electron microscope,the broken rate is above 97%,the appearance of a clear hole or fissure,UV analysis showed that 260nm and 280nm long absorption value than broken before more than 30%;microscopic reaction solution containing bacteria<10(in Escherichia coli,each ml number)reaction the mixture is solid-liquid separation system,used for food processing or production of health care products.

wall-broken of pollen,snail extract,eggshell egg whites,the instantaneous boiling water degeneration process,solid-liquid centrifugal separation.

文章來源：大學(xué)生思想教育創(chuàng)新課題

許意（1995-），安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院林學(xué)專業(yè)。

陶偉（1978-），助理研究員，從事林業(yè)方面的研究。