劉佳麗，王 梓，趙 莉，王瑞翀，李一經(jīng)，王 麗，唐麗杰，徐義剛，劉 敏，喬薪瑗

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030 ； 2. 黑龍江省疾病控制中心 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

2013-2014年黑龍江地區(qū)豬流行性腹瀉病毒檢測及M基因的遺傳進化分析

劉佳麗1，王 梓1，趙 莉1，王瑞翀2，李一經(jīng)1，王 麗1，唐麗杰1，徐義剛1，劉 敏1，喬薪瑗1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030 ； 2. 黑龍江省疾病控制中心 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種嚴重的病毒性傳染病。本試驗于2013-2014年在黑龍江省6個地級市的10個規(guī)模化豬場采集新生哺乳仔豬臨床表現(xiàn)為腹瀉癥狀的糞便與小腸，進行RT-PCR檢測，表明PEDV檢出率為56% ，PEDV+TGEV檢出率為6%，PRV檢出率為10%，TGEV檢出率為10%，結(jié)果表明，引起黑龍江省規(guī)?；i場新生仔豬腹瀉的主要病原是PEDV，同時也存在與其他腹瀉病毒的混合感染。針對陽性病料擴增出的6株P(guān)EDV的M基因序列進行遺傳進化分析，6株P(guān)EDV-M基因序列之間的核苷酸同源性為98.2%～99%，與疫苗株CV777的核苷酸同源性為97.6%～98.2%。利用MEGA 6.0構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示，擴增出的6條PEDV-M基因的遺傳進化樹分為兩大系，大部分遺傳距離較近，處于同一分支。其中LJJHD-M-13和LJJQ-M-14與泰國KU06RB08、泰國KU07RB08的親緣關(guān)系較近，LJJC-M-14、LJJJ-M-14、LJJH-M-13、LJMM-M-14這4株毒株與韓國M1595、韓國CPF259的親緣關(guān)系較近。同時擴增出的6條PEDV-M基因與CV777毒株非一系，與其親緣關(guān)系較遠，說明這些地區(qū)的PEDV流行毒株已經(jīng)發(fā)生變異，形成了獨特的流行進化分支。因此，本試驗通過對變異毒株基因序列進行分析，以期為研制新的疫苗和預(yù)防控制該病提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

豬流行性腹瀉病毒 ； M基因 ； 序列分析 ； 遺傳進化分析

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起的，以嚴重腹瀉及致死性水樣腹瀉為特征的豬腸道傳染病。感染的病豬死亡率可達到50%～90%[1]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

PEDV基因組中S、E、M和N基因分別編碼纖突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、核衣殼(N)蛋白。M基因的核苷酸序列與其他的冠狀病毒同源性較差(約50%)，但在不同的PEDV毒株中高度保守[2]。為探究黑龍江地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場新生仔豬PEDV的發(fā)病率以及與該病流行相關(guān)的潛在風險因素，本試驗對黑龍江省的規(guī)?；i場新生仔豬腹瀉病料進行了RT-PCR檢測和PEDV-M基因遺傳進化分析，為黑龍江省地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場預(yù)防和控制豬流行性腹瀉提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 本試驗于2013-2014年間，從黑龍江省地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場采集125份新生仔豬腹瀉病料，其中哈爾濱市的道外區(qū)豬場15份，哈爾濱市的巴彥縣洼興鎮(zhèn)豬場15份，雞西市城子河區(qū)豬場10份，雞西市雞冠區(qū)豬場10份，雞西市恒山區(qū)豬場10份，牡丹江市穆棱區(qū)豬場15份，鶴崗市興安區(qū)豬場10份，鶴崗市工農(nóng)區(qū)豬場10份，佳木斯市前進區(qū)豬場20份，齊齊哈爾市甘南縣豬場10份。并參照文獻[3-7]的方法采集樣品。

1.2 樣品的處理 將糞便樣品稱重，按1∶1比例加入糞便裂解液，渦旋震蕩后4 ℃ 梯度離心，反復(fù)凍融后于-70 ℃保存。

1.3 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 按照TRIZol 法提取病毒RNA。以病料總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄， -20 ℃保存?zhèn)溆?。按照文獻[8-10]中的方法進行PEDV-M基因的克隆，并將陽性重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 RT-PCR檢測 分別以PEDV、TGEV和PRV反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，同時設(shè)置陰性對照，用rTaq 酶進行RT-PCR檢測。

1.5 PEDV-M基因的遺傳進化分析 利用DNAMAN軟件，將6條PEDV-M基因的核苷酸序列與GenBank中已發(fā)表的19個參考毒株(見表1)的M基因的核苷酸序列進行同源性比較，并且利用MEGA 6.0繪制進化樹，對PEDV-M基因的遺傳進化進行分析。

表1 參考毒株序列

2 結(jié)果

2.1 腹瀉病料檢測結(jié)果 RT-PCR方法檢測結(jié)果見表2，PEDV檢出率為56%，PEDV+TGEV檢出率為6%，PRV檢出率為10%，TGEV檢出率為10%。PEDV的發(fā)生均在2-10日齡的新生哺乳仔豬階段，一年四季均可發(fā)生，病死率達100%。

2.2 PEDV-M基因的擴增及遺傳進化分析 6條PEDV- M基因核苷酸同源性為98.2%～99%，與疫苗株CV777的核苷酸同源性為97.6%～98.2%。將6條PEDV-M基因與GenBank中已經(jīng)發(fā)表的19株P(guān)EDV毒株的M基因進行比對，并利用MEGA 6.0構(gòu)建遺傳進化樹，由圖1可以看出： 6條PEDV-M基因的遺傳進化樹分為二個大系，大部分遺傳距離較近，處于同一分支。其中LJJHD-M-13和LJJQ-M-14與泰國KU06RB08、泰國KU07RB08的親緣關(guān)系較近，LJJC-M-14、LJJJ-M-14、LJJH-M-13、LJMM-M-14這4株毒株與韓國M1595、韓國CPF259的親緣關(guān)系較近，同時擴增出的6條PEDV-M基因與CV777毒株非一系，與其親緣性較遠。

表2 黑龍江省規(guī)?；i場病原檢測結(jié)果

圖1 PEDV -M基因遺傳進化樹

3 討論

本研究對2013-2014年黑龍江省的哈爾濱市、雞西市、牡丹江市、鶴崗市、佳木斯市和齊齊哈爾市6個地區(qū)發(fā)生新生仔豬腹瀉的10個規(guī)模化養(yǎng)豬場進行采樣，共收集病料125份。在本次調(diào)查中，母豬經(jīng)過T-P二聯(lián)疫苗免疫后新生仔豬仍可感染PEDV，由此說明疫苗免疫或者母源抗體并不足于保證新生仔豬免受現(xiàn)有PEDV流行毒株的感染。通過PCR擴增得到的PEDV-M基因核苷酸同源性比較發(fā)現(xiàn)，獲得的6條M 基因序列同源性較高，且與疫苗毒株CV777 M基因的同源性也比較高，說明M基因比較保守，是研究PEDV遺傳演化的優(yōu)先選擇基因。由PEDV-M基因的遺傳進化分析可知，擴增出的這6條PEDV-M基因與CV777非一系，親緣關(guān)系較遠，與泰國毒株、韓國毒株為一系，親緣關(guān)系較近，表明這些地區(qū)的 PEDV流行毒株已經(jīng)發(fā)生變異，形成了獨特的流行進化分支。通過對變異毒株基因序列的遺傳進化分析，可為新疫苗和免疫方法的研究奠定基礎(chǔ)，對預(yù)防和控制該病具有重要的意義。

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Molecularcharacterizationandphylogeneticanalysisofporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)fieldisolatesinHeilongjiang,China,2013—2014

LIU Jia-li1, WANG Zi1, ZHAO Li1, WANG Rui-chong2, LI Yi-jing1, WANG Li1, TANG Li-jie1, XU Yi-gang1, LIU Min1, QIAO Xin-yuan1

(1. Northeast Agricultural University, College of Veterinary Medicine, Harbin 150030, China; 2. Heilongjiang Provincial Center for Disease Control, Harbin 150030, China)

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the etiological agent of Pig epidemic diarrhea (PED).In this study, feces and small intestine of the neonatal piglets that were noted with signs of diarrhea were collected form 10 large-scale pig farms in six cities of Heilongjiang province from 2013 to 2014, and the RT-PCR analysis was used to detected the pathogens. The results showed that 56% of the samples were positive for PEDV, 6% of the samples were positive for PEDV and TGEV, 10% of the samples were positive for PRV and 10% of the samples were positive for TGEV. Our findings indicated that PEDV was the main pathogen that caused diarrhea of neonatal piglets in Heilongjiang province, and there was also a mixed infection with other diarrhea viruses. There were six PEDV-M gene sequences were detected by RT-PCR; The results showed that the nucleotide homology was 98.2%～99% among these genes, and the nucleotide homology between these stains and vaccine strain CV777 was 97.6%～98.2%.Genetic evolutionary tree was built by MEGA 6.0, and the result showed that the 6 PEDV-M genes were divided into two series, and most of the genetic distance was velatively close at the same branch. Compared with other Chinese isolates and foreign isolates, the 6 PEDV isolates had a closer genetic relationship with the Korea isolate M1595, CPF259 and Thailand isolates KU06RB08, KU07RB08, but had more distant genetic relationship with the vaccine strain CV777. Our results indicated that the PEDV epidemic strains in these areas had been mutated to form a unique branch of the popular evolution.

Porcine epidemic diarrhea virus ; M gene ; Sequence analysis ; Genetic evolution analysis

QIAO Xin-yuan

S852.62

A

0529-6005(2017)08-0007-03

2017-02-16

黑龍江省科學基金項目(C2016028)

劉佳麗(1991-)，女，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)學研究，E-mail：313225950@qq.com

喬薪瑗，E-mail:qiaoxinyuan@126.com