嚴 歡 ， 馬玉馨 ， 信愛國 ， 高華峰

(1. 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室 ， 云南 昆明 650024 ； 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 云南 昆明 650201)

小反芻獸疫病毒P蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白V表達特性研究

嚴 歡1,2， 馬玉馨1,2， 信愛國1， 高華峰1

(1. 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室 ， 云南 昆明 650024 ； 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 云南 昆明 650201)

從小反芻獸疫病毒全長cDNA中對磷酸化蛋白P及其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白V基因進行特異擴增，PCR產(chǎn)物回收后分別連接于T載體酶切及測序分析后，將其亞克隆至真核載體pEGFP-N2及原核表達載體pET32a, 獲得的真核表達質(zhì)料命名為pEGFP-P、 pEGFP-RV與空載體對照轉(zhuǎn)染Vero細胞, 經(jīng)濃度為800 μg/μL G418篩選后獲得均一表達，熒光定位觀察表明P蛋白與V蛋白的表達并不相同，P蛋白嚴格定位于細胞漿，而V蛋白則能在胞漿及胞核內(nèi)觀察到；獲得原核表達質(zhì)粒pET32a-P 和pET32a-RV在37 ℃通過條件優(yōu)化后以1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后分別收獲細胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western Blot對重組P、V蛋白的檢測，結(jié)果表明,重組P蛋白為90 ku,重組V蛋白為55 ku的可溶性融合蛋白，可溶性表達產(chǎn)物經(jīng)500 mmol/L 咪唑兩次純化后獲得80%以上純度的表達，純化得到的蛋白免疫兔子后能產(chǎn)生特異性抗體。

小反芻獸疫病毒 ； P/V蛋白 ； 細胞定位 ； 原核表達

小反芻獸疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus, PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒屬的成員，山羊高度易感。該病主要在非洲及中東地區(qū)流行，近年來在中國周邊國家頻繁發(fā)生，自2007年西藏自治區(qū)首次報道該病疫情[1-3]。2013年11月新疆再次暴發(fā)該病，由于山羊和綿羊的大面積流動，該病在國內(nèi)迅速傳播，至2014年9月不到一年的時間，全國共有22個省或自治區(qū)的256個縣暴發(fā)疫情。該病現(xiàn)已成為對養(yǎng)羊業(yè)危害較大的疫病，小反芻獸疫病毒磷酸化蛋白基因(P)及非結(jié)構(gòu)蛋白V在病毒天然免疫過程中起到關(guān)鍵作用，對這兩種蛋白的特性及功能研究對研究病毒的特性有重要意義[4-5]。本試驗通過真核及原核兩種不同方式表達了病毒P及非結(jié)構(gòu)蛋白V，研究其細胞定位及蛋白部分特性。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸埃希菌DH5a、真核載體pEGFP-N2及原核表達載體pET32a、小反芻獸疫病毒N75/1弱毒疫苗株及全長cDNA文庫由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存、Vero細胞系為云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存。

1.2 酶及試劑 各種工具酶，均購自TaKaRa公司，寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，購自晶美公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒及凝膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)為Promega公司產(chǎn)品；組氨酸His單抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 小反芻獸疫病毒的PCR擴增 根據(jù)小反芻獸疫病毒N75/1毒株序列，合成如下表1引物用于目的基因的擴增。參考全長文庫基因序列信息，用Primer Premier5.0設(shè)計用于擴增用于連接報告質(zhì)粒pEGFP-N2的結(jié)構(gòu)蛋白P及V：用primer mutation設(shè)計點突變引物。

表1 擴增病毒結(jié)構(gòu)蛋白P及其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白V及基因點突變的引物

注：斜體下劃線大寫字母為用于連接載體的酶切位點，黑體大寫字母為保護性堿基

1.4 重組表達載體的構(gòu)建 序列測定正確的P、V基因雙酶切陽性片段分別與雙酶切的pEGFPN2載體在T4連接酶作用下16 ℃連接16 h，構(gòu)建真核表達載體pEGFP-P、 pEGFP-RV及原核表達載體pET32a-P 和pET32a-V然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，涂板后培養(yǎng)14 h挑選構(gòu)建pEGFP-V，進行點突變及雙酶切鑒定。鑒定出的陽性克隆提取質(zhì)測序驗證并命名為pEGFP-RV。

1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與篩選 將提取的重組質(zhì)粒pEGFP-P、 pEGFP-RV與脂質(zhì)體混勻，加入無血清及抗生素細胞培養(yǎng)基混勻后于5% CO2培養(yǎng)24 h，通過梯度試驗加入終濃度為800 μg/μL的G418，培養(yǎng)8 d后進行細胞消化培養(yǎng)，經(jīng)兩代篩選培養(yǎng)后觀察重組蛋白的細胞定位。

1.6 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及純化 將測序正確的重組質(zhì)粒pET32a-P 和pET32a-RV 轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，在含有10 mg/L 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃搖菌過夜，后以1∶100 轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮的含10 mg/L 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。37 ℃搖菌2 h，A600 nm值 約為0.6時，加入IPTG至終濃度分別為0.01、0.10、1.0 mmol/L，37 ℃搖菌誘導(dǎo)4 h，6 000 r/min (4℃)低溫離心10 min 收菌。對上清液和沉淀均進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS‐PAGE)分析，判定表達形式。誘導(dǎo)表達的融合蛋白包含有6X His 片段，適用Ni‐NTA 樹脂親和層析法純化目的蛋白。

1.7 多抗血清的制備 分別用二次純化的蛋白20 mg P/V免疫兔子，以10 mg的劑量免疫二次免疫，加強免疫后7 d采血檢測。

1.8 SDS-PAGE電泳及Western Blot檢測 重組原核表達質(zhì)粒pET32a-P 和pET32a-RV分別加入IPTG 37 ℃誘導(dǎo)后收集細胞及血清，進行SDS-PAGE電泳，分析表達量大小及表達產(chǎn)物的可溶性，將SDS-PAGE電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，重組蛋白用含5%脫脂乳的TBST封閉4 ℃過夜，以抗6His標(biāo)鑒蛋白的單抗結(jié)合1 h后，顯色觀察其特異性條帶。

2 結(jié)果

2.1 小反芻獸疫病毒N75/1結(jié)構(gòu)蛋白P與非結(jié)構(gòu)蛋白V基因的克隆與鑒定 從全長文庫質(zhì)粒中用特異引物擴增P、V基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到與預(yù)期相符的大小分別為1 536 bp、895 bp的條帶，擴增的目的片斷膠回收后連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α，篩選陽性克隆，提取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和限制性內(nèi)切酶鑒定得到了與預(yù)期相符的核酸片段，將載體 pEGFP-N2與pMD19-T載體上目的基因進行雙酶切或單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接，酶切檢測構(gòu)建克隆的正確性，所構(gòu)建的融合表達載體分別命名為pEGFP-P及pEGFP-V, pEGFP-V通過在體外突變插入鳥嘌磷G，得到一個大小為896 bp的基因片段，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定及序列測定分析后命名為pEGFP-RV(見圖1)。

2.2 小反芻獸疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白P與非結(jié)構(gòu)蛋白V重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 提取重組質(zhì)粒pEGFP-N2、pEGFP-P、pEGFP-RV，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細胞Vero，轉(zhuǎn)染后于48 h后可觀察到大量表達，通過梯度試驗加入深度分別500 mg/mL～1 200 mg/mL的G418, 在深度為1 000 mg/mL時，能完全抑制未表達目的蛋白的Vero細胞，經(jīng)連續(xù)篩選4代后，建立穩(wěn)定表達P、V蛋白的重組細胞系， 通過熒光顯微鏡可觀察到小反芻獸疫磷酸化蛋白在轉(zhuǎn)染早期及穩(wěn)定表達后均嚴格定位于細胞漿內(nèi)，而空載體及非結(jié)構(gòu)蛋白V在細胞核在胞核及胞漿內(nèi)均有分步。見中插彩版圖2。

圖1 結(jié)構(gòu)蛋白基因P雙酶切電泳

2.3 小反芻獸疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白P與非結(jié)構(gòu)蛋白V重組質(zhì)粒的原核表達 將表達菌E.coliBL21(DE3)于37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600 nm值為0.6時，在誘導(dǎo)溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時間為4 h、IPTG 濃度依次0.01、0.1、1.0 mmol/L，在IPTG 濃度為1.0 mmol/L 時，目的蛋白的表達最高。在大腸桿菌DE3菌株中的誘導(dǎo)表達的蛋白部分以包涵體形式存在，大部分蛋白以可溶形式表達于上清中，目的蛋白P和V均獲得表達。見圖3。

2.4 小反芻獸疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白P與非結(jié)構(gòu)蛋白V重組質(zhì)粒的原核表達純化 將構(gòu)建的原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3菌株，在37 ℃下，經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，使蛋白充分表達。沉淀重懸于后進行超聲破碎，取上清加入1 mL 50%Ni-NTA樹脂。將結(jié)合有目的蛋白的Ni-NTA樹脂裝柱。用不同濃度的咪唑漂洗液(10、 20、 50、 100、 250、500 mmol/L)選擇漂洗條件。最終用500 mmol/L咪唑溶液洗脫目的蛋白。利用Ni-NTA樹脂進行純化，用高濃度的咪唑溶液洗脫，收集不同時間組分發(fā)現(xiàn)，第1次洗脫的蛋白產(chǎn)量較高，但所含雜志較多，第2次洗脫后SDS-PAGE膠顯示在55 ku處有一條明顯的條帶，但仍有少量雜質(zhì)，第3次則很少收到蛋白質(zhì)，因而選擇二次洗脫，濃縮后500 mmol/L咪唑洗脫液中蛋白V濃度約1.4 mg/mL, 純度約80%。見圖4。

圖3 蛋白質(zhì)電泳結(jié)果

M: 非預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下分別是116、 66.2,45、 35、 25、 18.4、 14.4 kD； 1～4: BL21(pET32a-P) 分別為未誘導(dǎo)前上清、沉淀和0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后上清、沉淀; 5～8:BL21(pET32a-RV) 分別為未誘導(dǎo)前上清、沉淀和1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)后上清、沉淀

圖4 蛋白純化電泳結(jié)果

A M: 非預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)， 從上到下分別是 116、 66.2、 45、 35、 25、 18.4、 14.4 ku； 1,8:分別為濃縮濾液； 2,6: 1mg/mL BSA3； 7: 0.8 mg/mL BSA： 3: 50 mmol/L咪唑洗脫液濃縮 5: 500-1mmol/L咪唑洗脫液濃縮 B M:中分子量蛋白Marker，從上到下依次為90、 66、 45、 35、 29、 20、 14.4 Ku； 1: V蛋白； 2,3: 分別為1.2, 1 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品

2.5 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western Blot檢測 收集培養(yǎng)物，純化重組蛋白進行Western Blot 鑒定，抗體為抗6X His 單克隆抗體，表明融合基因在E.coliBL21(DE3)中正確表達，通過間接法分析融合蛋白的表達可見P/V基因在表達，表達產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為90 ku 及55 ku，P/V蛋白抗6His(祖蛋白)標(biāo)鑒蛋白的單抗進行檢測，檢測出特異性條帶(圖5A)。P/V純化蛋白免疫的兔血清，經(jīng)抗體為HRP標(biāo)記的山羊抗兔血清檢測出大小在90 ku 及55 ku的相應(yīng)蛋白，表明P/V兩種蛋白在細胞中均得到正確表達，并能被表達的重組蛋白識別，初步具備了生物學(xué)活性。

圖5 融合蛋白的Western Blot檢測

A: 融合蛋白的P/V基因兩次純化后的重組蛋白鑒定；B: 兩次純化的融合蛋白P/V免疫兔子后制備血清抗體的Western Blot檢測

3 討論

小反芻獸疫病毒屬麻疹病毒科的一個成員，P基因編碼-含507個氨基酸、分子量為55 ku的蛋白。這樣的分子量遠比根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳估計的75 ku，這是因為在P蛋白合成后，大量的磷酸鹽殘基加到蛋白上，造成蛋白的異常遷移[10]。V蛋白是mRNA轉(zhuǎn)錄過程中由加到其751位點的額外G殘基合成的，加上殘基就導(dǎo)致了原閱讀框的改變，新形成的ORF比先前的短，編碼一個含299個氨基酸、C端富含半胱氨酸、N端序列與P蛋白N端相同的蛋白V。對麻疹病毒的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，病毒的體內(nèi)感染能導(dǎo)致先天免疫的尚失，深入的研究表明，麻疹病毒V蛋白通過與mda-5結(jié)合從而阻止干擾素的產(chǎn)生，通過反向遺傳技術(shù)將C基因突變而V基因仍然表達的毒株能誘導(dǎo)更高水平的干擾素，表明基因在干擾素抑制過程中起到重要作用[6-7]。本次通過原核表達的兩種融合蛋白一個大小為90 ku，另一個大小55 ku，均比預(yù)期的蛋白偏大，非結(jié)構(gòu)蛋白V預(yù)計大小為35 ku左右，結(jié)果表明，該蛋白也存在一定的修飾加工，由于經(jīng)磷酸化基因編輯而來，存在磷酸化效應(yīng)。

結(jié)構(gòu)蛋白P及其編碼的非結(jié)構(gòu)的表達，本研究采用兩種方式得到所研究的非結(jié)構(gòu)蛋白，一種方式是通過定點突變得到編碼完整讀碼框的非結(jié)構(gòu)蛋白P，然后與含報告基因的真核表達質(zhì)粒pEGFP-N2連接，經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)染研究所需的細胞，本研究中構(gòu)建后的載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Vero細胞，利用熒光蛋白的細胞定位可觀察到這兩種尚未充分研究的蛋白的亞細胞定位，本研究中磷酸化蛋白及其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白V均定位于胞漿內(nèi)，這種定位方式也與預(yù)期一致，由于RNA病毒不進入細胞核復(fù)制，因此，即使負責(zé)與核蛋白結(jié)合并使后者處于可溶狀態(tài)，增強核蛋白轉(zhuǎn)錄效率的磷酸化蛋白，其在胞內(nèi)定位均位于胞漿內(nèi)，而非結(jié)構(gòu)蛋白也只在胞漿內(nèi)進行表達。

病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在原核表達系統(tǒng)中多以包涵體形式存在，尤其是對于分子質(zhì)量較大的蛋白，可溶性表達的幾率很低，本研究表明，小反芻獸疫磷酸化基因P及非結(jié)構(gòu)蛋白V在細菌BL21中能得到高效表達，并可用鎳柱高效純化。純化蛋白免疫兔子后，免疫血清能被純化的蛋白識別，表明蛋白具有生物學(xué)活性，血清中和實驗則表明兩種蛋白均不能產(chǎn)生中和抗體，這與現(xiàn)有文獻報道相一致，這也為更多蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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ExpressionofP/VGeneofPestedesPetitsRuminantsVirusandtheStudiesoftheBiologicalCharacteristics

YAN Huan1,2, MA Yu-xin1,2, XIN Ai-guo1, GAO Hua-feng1

(1. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Viral Disease Laboratory, Kunming 650224, China；2. College of Veterinary Medicine,Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

The P/V gene fragment of peste des petits ruminants vaccine strain N75/1 was amplified by PCR from cDNA library, and the purified products were cloned into pMD19-T vector. Confirmed with enzyme digestion and sequence analysis, P and V gene was subcloned into vector pEGFP-N2 and pET32a. The eukaryotic expression vector with p/v gene was constructured and finally named pEGFP-P，and pEGFP-RV, respectively. The recombinant plasmid with P/V gene and the empty vector control was transfected into Vero cells and the cells were selected with G418. The PPRV P gene was expressed only in cytoplasm. Prokaryotic Expression vector of pET32a with P/V gene was constructed and named as pET32a-P and pET32a-RV respectively. The fusion protein was induced by IPTG with the final titer 1.0 mmol/L at 37℃. Fusion protein mainly expressed in the supernatant was purified with NI-NTA spin with 500 mmol/L imidazole twice and used to immunize the rabbits to prepare polyclonal antibodies. The results showed that the molecular weight of recombinant protein was about 90ku and 55ku.The antiserum of rabbits analyzed by western blotting showed that the bands at 90ku and 55ku molecular weights were detected. It shows that the two purified proteins have biological functions.

Peste des petits ruminants virus ; P/V protein ; cellar location ; expression

GAO Hua-feng

S855.3

A

0529-6005(2017)08-0003-04

2017-01-18

國家自然科學(xué)基金項目(31160499)

嚴歡(1993-)，女，碩士，主要從事動物病毒學(xué)研究,E-mail：huanzai920@sina.com

高華峰，E-mail：kmghf@hotmail.com