趙志紅

(天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300350)

腹腔注射給藥Ghrelin對小鼠神經(jīng)再生的影響*

趙志紅

(天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300350)

目的 探討腹腔注射給藥Ghrelin對小鼠海馬神經(jīng)再生的影響。方法 本研究將小鼠隨機分為Ghrelin組及對照組，兩組均腹腔注射相同劑量BrdU (100 mg/kg, 早晚各1次，連續(xù)5天),目的用來標記海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)(Subgranular Zone，SGZ)增生的細胞。處理組小鼠給予腹腔注射Ghrelin(80 μg/kg, 一天一次，連續(xù)8 d)，而對照組注射等量的生理鹽水。1周后進行免疫組化分析。結(jié)果 BrdU 免疫陽性(BrdU+)細胞在海馬齒狀回中廣泛表達; Ghrelin處理組BrdU+細胞數(shù)顯著多于生理鹽水對照組(t=3.43，P<0.01)。結(jié)論 腹腔注射Ghrelin(80 μg/kg)促進海馬齒狀回神經(jīng)再生。

Ghrelin ；BrdU；海馬；神經(jīng)再生

Ghrelin是一種肽類激素，由28個氨基酸構(gòu)成，起初被發(fā)現(xiàn)是從鼠的胃中分離出的，且其受體為生長激素促泌素受體(GHSR)[1]，多肽類Ghrelin由胃內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生及分泌[2]，隨后釋放到全身體循環(huán)發(fā)揮相應(yīng)的效應(yīng)。迄今為止，GHS-R1a是發(fā)現(xiàn)的唯一一個有功能的Ghrelin受體，這種典型的受體，即G蛋白偶聯(lián)的7-跨膜受體，最開始是在垂體和下丘腦中表達[3]。此外， GHS-R1a也在海馬齒狀回也有高度表達，大量研究已經(jīng)證實，Ghrelin影響垂體激素的分泌、食欲、代謝、胃腸功能系統(tǒng)。但關(guān)于Ghrelin對神經(jīng)細胞的影響的研究幾乎未涉及過，本研究將探討腹腔注射給藥Ghrelin對小鼠海馬神經(jīng)再生的影響。

1 材料和方法

1.1材料

該實驗選用的小鼠，為成熟雄性小鼠(C57/Bl6)，2～3個月，體重約25～30 g，在北京維通利華公司購買。小鼠生活的環(huán)境：室溫(22±1)℃，濕度 (40%±5%)，且24 h晝夜循環(huán)飼養(yǎng)，飲水和進食自由。

1.2重要試劑與相關(guān)儀器

Ghrelin：由美國phoenix公司提供，用0.9%鹽水配成300 μM溶液，并凍存于80 ℃，當(dāng)使用時再稀釋所需濃度。BrdU：購買于美國sigma公司， 直接用0.1 MPBS溶液配成100 mg/kg。一抗：BrdU抗體(Rat)，美國ABD公司產(chǎn)品， (11)二抗：Alexa Fluor 488 chicken anti-Rat，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；封閉用羊血清、甘油、Triton-X-100、PBS緩沖液由上海試劑一廠產(chǎn)品。CM-1900冰凍切片機(Leica，德國)；LSM高靈敏度激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, Jena， 德國)。

1.3實驗方法

1.3.1分組 將小鼠隨機分為Ghrelin組及對照組，每組20只，兩組均腹腔注射相同劑量BrdU(100 mg/kg，早晚各1次，連續(xù)5天),目的用來標記海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)(Subgranular Zone，SGZ)增生的細胞。處理組小鼠給予腹腔注射Ghrelin(80 μg/kg, 一天一次，連續(xù)8天)，而對照組注射等量的生理鹽水。

1.3.2取材及標本制備 將小鼠用8%水合氯醛溶液(400 mg/kg)充分麻醉后，開胸，充分暴露心臟，將針頭從心尖刺入左心室，快速灌注生理鹽水，待雙肺變白換為4%多聚甲醛溶液，灌注30 min后斷顱取腦，置于4%多聚甲醛溶液中24 h。然后把腦組織轉(zhuǎn)移至30%蔗糖中，浸泡約24～48 h，用包埋液把小鼠腦包埋好，放置到振動式切片機固定好，制作為50 μm厚度的水平面腦片，背側(cè)海馬的腦片全部收藏(24～32張)，分為4套，每套6～8張腦片，后置于24孔板里，并放置4 ℃冰箱保存。各只小鼠挑選1套腦片，行免疫熒光染色。

1.3.3免疫熒光染色步驟 對所選腦片采用漂染法，并行免疫熒光染色。操作步驟如下：將腦片用0.1 MPBS漂洗3次，后轉(zhuǎn)到1 N鹽酸(HCl)孵育半小時，該過程在45 ℃水浴鍋進行，目的是使DNA變性(將其雙鏈打開)，轉(zhuǎn)到0.1 MPBS漂洗3次，每10 min漂洗一次，后將所有腦片置于封閉液中孵育1 h，目的是減輕或消除一些非特異性反應(yīng)，本次之后不漂洗，后轉(zhuǎn)到一抗溶液[BrdU (Rat 1∶500)](由封閉液配制)，再孵育48～72 h，該過程需避光并在4 ℃搖床進行，使腦片充分接觸；轉(zhuǎn)到0.1 M PBS漂洗3次，每10 min漂洗一次；再轉(zhuǎn)至封閉液配制的二抗溶液中，該過程在常溫即可，但需錫箔紙包裹，且避光孵育2 h，轉(zhuǎn)到0.1 MPBS漂洗3次，每10 min漂洗一次；將腦片轉(zhuǎn)到載玻片上，需較暗的環(huán)境下進行，后避光晾干，滴上含甘油的保護液，用蓋玻片封閉，最后將處理好的腦片全部置于4 ℃冰箱內(nèi)備用；用熒光共聚焦顯微鏡掃描計數(shù)。

1.4統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1BrdU+細胞在海馬齒狀回表達

箭頭所示綠色信號為BrdU+細胞，見圖1，兩組熒光免疫組化結(jié)果顯示，BrdU+細胞在海馬齒狀回均廣泛表達(200倍)。

2.2兩組BrdU+細胞數(shù)比較

Ghrelin處理組BrdU+細胞數(shù)(202.91±11.83)與生理鹽水對照組(157.20±6.17)比較，見圖2，差異有顯著意義(t=3.43，P<0.01)。

圖1 兩組BrdU+細胞的表達

圖2 兩組BrdU+細胞數(shù)比較

3 討 論

海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)(subgranular zone，SGZ)神經(jīng)元具有干細胞特點，即自我更新和多向分化等潛能，因此被稱為神經(jīng)干細胞(adult neural stem cell，ANSC)。在嚙齒動物中，SGZ的細胞再生功能自始至終存在，但是并隨著年齡的增加而逐漸減弱[4]。本研究結(jié)果揭示了海馬齒狀回神經(jīng)細胞具有再生能力，同時證明了Ghrelin促進海馬齒狀回神經(jīng)再生。5-溴脫氧尿核苷(5’-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU)，一種胸苷類似物，參與細胞有絲分裂DNA合成，且同內(nèi)源性胸苷相互競爭性的結(jié)合到DNA中。研究顯示，BrdU一旦結(jié)合到DNA中，就持續(xù)存在，而且隨著細胞有絲分裂逐步傳遞給下一代。應(yīng)用特異性的抗體作用于已固定的的腦組織，發(fā)現(xiàn)在幾天，幾周，幾個月，或是幾年之后仍可檢測BrdU標記的神經(jīng)元[5]。通常來說，小鼠腹腔注射BrdU，可通過血腦屏障，這是關(guān)于神經(jīng)細胞再生相關(guān)研究的金標準。BrdU標記可以檢測到神經(jīng)再生中增生細胞[6-8]。在嚙齒類動物中，SGZ每天都會產(chǎn)生許多新生的神經(jīng)元，通常在給藥BrdU三天后，BrdU標記的新生神經(jīng)細胞數(shù)目達到最高峰，其后新生神經(jīng)元隨時間推移因凋亡逐漸減少。狹義神經(jīng)再生是指成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細胞的增殖和神經(jīng)元的分化。廣義神經(jīng)再生除了該項內(nèi)容，還包括另一階段即新形成的神經(jīng)元的存活，本研究證實了腹腔給藥 Ghrelin促進海馬齒狀回神經(jīng)再生。但外源性Ghrelin是否可以保護腦缺氧缺血而造成的細胞死亡，仍需進一步研究。倘若可以提高神經(jīng)元存活，又是通過何種機制呢，需進一步研究探討。

記憶功能障礙相關(guān)性疾病與海馬神經(jīng)元病態(tài)有密切關(guān)系，相對比較常見的是與缺血性腦損傷及癲癇等疾病。相關(guān)研究顯示，在缺血性腦損傷中，記憶力減退及認知功能障礙可由海馬神經(jīng)元缺失或退化引起。常見的生長因子，比如胰島素樣生長因子-1、血管內(nèi)皮生長因子，可直接作用于海馬新神經(jīng)元再生，或者間接途徑通過神經(jīng)營養(yǎng)促進作用而提高海馬新生神經(jīng)元存活[9]。而另一些研究證明，在癲癇后出現(xiàn)的記憶損害與神經(jīng)再生也有相關(guān)聯(lián)系，即抑制海馬神經(jīng)再生[10-11]。腹腔注射Ghrelin促進海馬齒狀回的神經(jīng)再生，然而海馬神經(jīng)損害可以被缺血性腦損傷及癲癇所誘發(fā)，綜上所述，給藥Ghrelin刺激海馬神經(jīng)再生，這一促進效應(yīng)在提高認知能力以及抑制神經(jīng)元缺失或凋亡等方面都起著重要作用，這一說法好像合乎情理，但仍需進一步研究探討核實。

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Effects of intraperitoneal injection of Ghrelin on neural regeneration in mice

ZHAO Zhi-hong

(Dept.of Neurology,Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300350,China)

Objective:To explore the effect of intraperitoneal injection of Ghrelin on hippocampus neurogenesis.Methods： Mice were randomly divided into Ghrelin group and control group.Both groups were given intraperitoneal injection of equal BrdU (100 mg/kg, twice a day, continuous injection of 5 days) to mark proliferating cells of the hippocampal dentate gyrus Subgranular Zone(SGZ). Ghrelin was given intraperitoneal injection (80 μg/kg, once a day, continuous injection of 8 days), the control group mice were offered same volume normal saline. After 1 week, both were immunohistochemical analysis.Results：BrdU-immunopositive cells widely expressed in the hippocampal dentate gyrus, the number of BrdU+ cells observed in Ghrelin treatment groups were significantly much more than that in control groups(t=3.43，P<0.01).Conclution：Our results indicated that intraperitoneal injection of Ghrelin (80 μg/kg) induced neurogenesis in hippocampus.

Ghrelin;BrdU;hippocampus;neurogenesis

趙志紅(1985—)，女，天津人，醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)內(nèi)科工作。

R741

A

1004-7115(2017)10-1126-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.015

2017-08-18)