溫世杰+李杏瑜+洪彥彬+李少雄+周桂元+陳小平+梁炫強(qiáng)

摘 要 植物中的Δ12脂肪酸脫氫酶（FAD2）是油酸形成亞油酸的關(guān)鍵酶。通過NCBI和EXPASY 2大數(shù)據(jù)庫，采用SignalP、TMHMM、Psort、ProtParam和TargetP等分析程序?qū)ㄉ贩N‘航花2號及其它物種的19個FAD2蛋白序列進(jìn)行分析，利用MEGA6.0軟件比對序列及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹闡明FAD2基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，親緣相近的FAD2蛋白聚在一起。預(yù)測了‘航花2號和‘粵油13的FAD2蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、信號肽、跨膜和保守結(jié)構(gòu)域等。結(jié)果表明：‘航花2號FAD2蛋白的N端沒有信號肽，預(yù)測定位在微體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體基質(zhì)和葉綠體類囊膜中，而C端信號基序LKGL使得FAD2蛋白選擇性地結(jié)合和嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物的FAD2蛋白普遍有3個高度保守的組氨酸富集基序（HECGHH、HRRHH和H[A/C/T]HH）和3～5個跨膜結(jié)構(gòu)，但分析結(jié)果顯示，‘航花2號的FAD2蛋白的H[A/C/T]HH的組氨酸基序是缺失的，而油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的效率上并沒有顯著變化，為將來FAD2基因的基因工程操作提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 花生 ；脂肪酸脫氫酶 ；生物信息學(xué) ；油料作物

中圖分類號 Q946.81 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.09.008

Bioinformatic Analysis of Delta-12 Fatty Acid Desaturase 2（FAD2）

WEN Shijie LI Xingyu HONG Yanbin LI Shaoxiong

ZHOU Guiyuan CHEN Xiaopin LIANG Xuanqiang

（Crops Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key

Laboratory for Crops Genetic Improvement / South China Peanut Sub-Center of National

Center of Oilseed Crops Improvement， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract Delta-12 fatty acid desaturase 2 （FAD2） was a key enzyme to insert oleic acid to linoleic acid. Through the NCBI and EXPASY 2 database， nineteen FAD2 protein sequences from peanut Hanghua 2 and other species of plants were analyzed by SignalP， TMHMM， Psort， ProtParam and TargetP procedures. The phylogenetic relationship of FAD2 was elucidated by neighbour-joining tree and MEGA6.0. FAD2 proteins with high similarity sequence were clustered. The molecular mass， isoelectric point， signal peptide， trans-membrane and conserved domains of FAD2 protein were predicted for peanut Hanghua 2 and Yueyou 13. The results showed that there was no signal peptide of N-terminal of FAD2 in Huanghua 2. The FAD2 proteins were predicted in microbody， cytoplasm， mitochondrial matrix space and chloroplast thylakoid membrane. C-terminal signaling motif LKGL allows FAD2 proteins to selectively bind and embed in the endoplasmic reticulum. The FAD2 proteins included three highly conserved histidine-rich motifs （HECHH， HRRHH and HV[A/C/T]HH） and three to five transmembrane anchors. But C-terminal of FAD2 in Huanghua 2 was lack of HV[A/C/T]HH histidine motif. No change was observed in efficiency of insertion of oleic acid to linoleic acid. This could be used for genetic engineering of FAD2 gene in the future.

Keywords peanut ； fatty acid desaturase ； bioinformatics ； oilseed crops

油料作物是人類重要的食材之一[1]，同時也被廣泛用于醫(yī)藥、化妝、乳化劑等領(lǐng)域，是重要的經(jīng)濟(jì)作物[2-3]。油料作物中，脂肪酸是種子的主要貯存脂質(zhì)和重要的能量來源。脂肪酸脫氫酶在脂肪酸代謝過程中起著在烴鏈中引入雙鍵的功能。脂肪酸脫氫酸分成兩類，一類是可溶性蛋白脫氫酶（ACP-desaturas），另一類是膜結(jié)合脂肪酸脫氫酶。質(zhì)體中的脫氫酶的電子供體通常是鐵氧化還原蛋白，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脫氫酶則是細(xì)胞色素b5[4]，質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生的脫氫反應(yīng)是通過2種不同的途徑發(fā)生的[5]。甘油三酯在菜油中大多由棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸這5種脂肪酸組成[6]。植物油的質(zhì)量主要取決于油酸和亞油酸的含量。這2種不飽和脂肪酸的比例決定了食用油的營養(yǎng)特性和穩(wěn)定性。脂肪酸脫氫酶（FAD2）是在油酸的Δ12位置形成雙鍵從而轉(zhuǎn)變?yōu)閬営退岬年P(guān)鍵酶[5]，在生物膜系統(tǒng)、信號、能量儲存、熱適應(yīng)和抗生物或非生物脅迫中起著至關(guān)重要的作用[5，7]。FAD2基因推導(dǎo)的氨基酸有3個典型的保守組氨酸框，是氧化激活和底物氧化的場所[8-10]。endprint

花生籽粒中含油量約占種子干重的46%～57%，其中可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。在不飽和脂肪酸中，油酸和亞油酸的含量最高，兩者約占總脂肪酸的80%[11-12]。油酸和亞油酸的相對含量對花生油的營養(yǎng)與貯藏影響很大。由于高濃度的亞麻酸或亞油酸容易發(fā)生氧化變質(zhì)，導(dǎo)致植物油酸敗。為了解決這個問題，往往通過化學(xué)加氫的方法增加油酸含量和減小多不飽和脂肪酸的含量，但這樣做會產(chǎn)生反式脂肪，反式脂肪與心臟病和Ⅱ型糖尿病的發(fā)病相關(guān)[13]。而高油酸的花生制品不容易氧化變質(zhì)延長了保質(zhì)期，可以降低膽固醇水平，有利于健康[14-15]。因此，利用基因工程改善植物油的穩(wěn)定性是必要的[6，16]?！交?號是由‘粵油13搭載返回式衛(wèi)星，返回地面后經(jīng)多代選育而成的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)花生品種。本研究是利用生物信息學(xué)分析‘航花2號的FAD2基因結(jié)構(gòu)、功能和闡明系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系，為下一步花生FAD2基因工程提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

‘航花2號廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所育成的花生品種，2012年通過廣東省農(nóng)作物品種審定委員會審定，2013年通過全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心農(nóng)作物品種鑒定。

‘粵油13廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所育成花生品種，2006年通過廣東省農(nóng)作物品種審定委員會審定，同年通過全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心農(nóng)作物品種鑒定。

1.2 FAD2基因序列的獲得與收集

利用天根植物基因組DNA提取試劑盒（NO.DP305）提取以上2個品種的基因組DNA。

利用同源克隆的方法，設(shè)計引物為FAD2-sense：ACACAACAATGGGAGCTGGA FAD2-antisense ：ATGGCAAATCCACACACACA，獲得‘航花2號和‘粵油13花生品種的序列，其它序列從NCBI（http：//www.ncbi.nih.gov）收集如表1。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI（http：//www.ncbi.nih.gov）和EXPASY（http：//expasy.org/tools）這2個網(wǎng)站在線分析FAD2蛋白序列，利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析序列的基序，利用MEGA軟件中的Clustalw算法，進(jìn)行多序列比對并生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）來預(yù)測信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，以及其它生物信息學(xué)工具預(yù)測分子量，等電點(diǎn)，氨基酸組成和半衰期等。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘航花2號FAD2基因序列及推導(dǎo)氨基酸信息

通過同源克隆的方法電泳圖1測序得的‘航花2號和‘粵油13的FAD2基因序列（圖2、3）。由Protparam程序預(yù)測，‘航花2號的FAD2蛋白長度為245 aa，分子量為28 152.74 u，等電點(diǎn)為9.45，分子式為C1325H1972N332O334S8，氨基酸組成包括13個帶負(fù)電的氨基酸和24個帶正電的氨基酸，計算的不穩(wěn)定指數(shù)值為37.97，說明它是一個穩(wěn)定的蛋白蛋?！浻?3的FAD2蛋白長度為379 aa，分子量為43 588.22 u，等電點(diǎn)為8.78，分子式為C2045H3018N514O528S12氨基酸的組成包括了28個帶負(fù)電的氨基酸和34個帶正電的氨基酸，計算的不穩(wěn)定指數(shù)值為38.08，說明這是一個穩(wěn)定的蛋白質(zhì)[17]。

2.2 不同來源的FAD2蛋白的比對與基序分析

為了闡明FAD2基因的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育關(guān)系，利用MEGA6.0軟件對這19個蛋白進(jìn)行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。如圖4可知，此系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為3組，花生和大豆都是同一組中，比對結(jié)果，花生之間差異不大，花生與大豆的FAD2蛋白的同源性有86%。對‘航花2號和‘粵油13以及來自15個不同物種的17個FAD2蛋白進(jìn)行多重比對，通過MEME分析保守基序，具體的參數(shù)為默認(rèn)值，共有3個保守的基序，第一個保守組氨酸基序?yàn)镠ECGHH，第二個高度保守的組氨酸基序是HRRHH，但紅花亞麻除外，紅花亞麻是由4個疏水性脯氨酸替代這個基序。第三個組氨酸基序?yàn)镠V[A/C/T]HH，在它兩邊存在有2個高度保守的基序：EWDWLRGALAT和LFSTMPHYHAMEA（圖2、5）。據(jù)報道這些保守的組氨酸基序可能是一種鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，由于‘航花2號的FAD2翻譯提前中止，它的第三個組氨酸基序是缺失的。

2.3 預(yù)測‘航花2號的FAD2蛋白定位

利用Psort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）[18]，TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[19]和SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）3種不同算法預(yù)測‘航花2號N端信號的細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，‘航花2號的FAD2蛋白N端沒有信號肽，預(yù)測定位在微體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體基質(zhì)和葉綠體類囊體膜中。這個蛋白質(zhì)不存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留基序（KDEL），但在C端有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜保留信號KKXX-like基序?yàn)長KGL。‘粵油13信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)同樣沒有信號肽，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（膜）、質(zhì)膜、微體（過氧物酶體）和線粒體內(nèi)膜。這個蛋白同樣不存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留基序（KDEL），在C端不但有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜保留信號KKXX-like基序?yàn)閅KNK，還存在NKF氨基酸序列，在C端的NKF已經(jīng)被證實(shí)是一種糖基酶目標(biāo)信號[20]。在所選擇的大多數(shù)FAD2蛋白中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢索序列為YNNKL，而在上述序列的同源序列為Y（K/N）NKF或者YRNKI。降低基序保守性可能表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢索信號的損失，導(dǎo)致酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中解離[21]。‘航花2號C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢索基序?yàn)長KGL使其更有選擇性地結(jié)合和嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。endprint

2.4 ‘航花2號的FAD2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

脂肪酸脫氫酶（FAD2）通常包含有5個跨膜結(jié)構(gòu)，3個組氨酸盒子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢索基序[22]。FAD2蛋白N端的酶的活性區(qū)域必須是疏水殘基，通常是組氨酸富集基序，保守的組氨酸結(jié)構(gòu)域在酶功能中起至關(guān)重要的作用，一個組氨酸的替換都有可能破壞酶的功能[23]。由ProtScale程序下的Kyte and Doolittle方法[24]得到圖6-A，從圖6-A可見，‘航花2號的FAD2蛋白有4個疏水峰，分別在44-66 aa、79-101 aa、174-196 aa和219-241 aa的位置。利用TMHMM軟件預(yù)測跨膜螺旋見圖6-B，由圖6-B可見4個跨膜結(jié)構(gòu)域。而由圖6-C可知，‘粵油13的FAD2有4個跨膜結(jié)構(gòu)域。序列跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測見表1。由表1可知，除了紅花亞麻只有3個跨膜結(jié)構(gòu)域外，其它都有4-5個跨膜結(jié)構(gòu)域。呈現(xiàn)出不同來源的FAD2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量不同，可能與底物的特異性有關(guān)[25]?！交?號與‘粵油13的FAD2跨膜結(jié)構(gòu)是相似的，預(yù)示了‘航花2號和‘粵油13的FAD2功能其活性也可能相似。

2.5 ‘航花2號與‘粵油13的主要油分比較

由于FAD2基因是公認(rèn)的油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵基因，上述結(jié)果已表明，‘航花2號的FAD2翻譯被提前中止。通過近紅外光譜儀分析‘航花2號和‘粵油13的種子（圖7），結(jié)果表明，‘航花2號和‘粵油13的的主要油分含量相近，并無顯著變化。這說明‘航花2號和‘粵油13的FAD2功能活性相同。

3 結(jié)論與討論

所有高等植物中，亞油酸的合成都是在油酸的C12和C13位置之間插入雙鍵形成的。雖然FAD2酶目前為止還沒有晶體結(jié)構(gòu)，但是其預(yù)測結(jié)構(gòu)被公認(rèn)為負(fù)責(zé)油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的酶。這些特征包括位于3～5個跨膜結(jié)構(gòu)之間的高度保守的組氨酸富集基序，除此之外還有一個重要的結(jié)構(gòu)特征就是使它們選擇性結(jié)合或嵌入在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號基序，在這個基序上的任何突變都會引起酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的解耦和在質(zhì)膜的錨定[26]。通過比對來自不同油料作物的19個蛋白序列，識別出可能的3個高度保守的區(qū)域。所有FAD2蛋白序列的第一個組氨酸基序都是HECGHH，而且丙氨酸是緊隨著第一個組氨酸盒子；第二個組氨酸基序是高度保守的HRRHH，雖然紅花亞麻并沒有這個特征，但在這個區(qū)域用了4個疏水性的脯氨酸代替了組氨酸盒子。第三個組氨酸基序?yàn)镠V[A/C/T]HH，在第三個組氨酸盒子前后存在兩個高度保守的基序：EWDWLRGALAT和LFSTMPHYHAMEA。如此長的高度保守的組氨酸同源基序可能是一種鐵離子結(jié)合位點(diǎn)。蛋白質(zhì)可能在3個組氨酸盒的間隔處螺旋。由上述結(jié)果可知，‘航花2號可能受太空輻射影響，F(xiàn)AD2翻譯提前中止，第三個組氨酸盒及其兩端的保守基序的缺失，對其油酸轉(zhuǎn)化亞油酸的活性或轉(zhuǎn)化效率沒有影響，‘航花2號和‘粵油13二者的主要油分含量，特別是油酸和亞油酸含量都沒有顯著變化。預(yù)示著‘航花2號的FAD2基因的這種缺失可能未改變其油酸轉(zhuǎn)化亞油酸的轉(zhuǎn)化活性，但是否對其離子結(jié)合特別是鐵離子的結(jié)合產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步的驗(yàn)證，可為將來對FAD2基因的基因工程操作提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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