葉照楠，何 璐，張琳琳，李飛飛，劉文真

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.中國(guó)水稻研究所，水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 富陽(yáng) 311400）

CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻B R降解相關(guān)基因的研究

葉照楠1,2，何 璐1，張琳琳1，李飛飛1，劉文真2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.中國(guó)水稻研究所，水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 富陽(yáng) 311400）

油菜素內(nèi)酯（BR）是一種常見(jiàn)的植物類激素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，對(duì)水稻株型改良和抗逆性有重要作用。研究首先構(gòu)建了水稻4個(gè)BR降解相關(guān)基因的CRISPR/Cas9載體；然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將構(gòu)建好的4個(gè)BR降解相關(guān)基因的 CRISPR/Cas9載體分別轉(zhuǎn)化水稻中花11的愈傷組織，用50 mg/L的潮霉素作為篩選標(biāo)記，共獲得395株轉(zhuǎn)基因植株。其中，有270株屬于野生型，61株屬于雜合子類型，64株屬于突變類型；64株突變體中有39株是雜合突變體，25株是純合突變體，純合突變的概率為6.25%。4個(gè)基因均獲得了突變材料，但不同基因的突變效率不同，其中轉(zhuǎn)LW26的植株突變率高達(dá)41%。

油菜素內(nèi)酯（BR）相關(guān)基因；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；水稻遺傳轉(zhuǎn)化；靶位點(diǎn)鑒定

CRISPR/Cas9是最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)靶基因進(jìn)行定向編輯的技術(shù)，是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來(lái)的獲得性免疫防御機(jī)制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于CRISPR系統(tǒng)中的Ⅱ型系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包含crRNA（CRISPR RNA）、tracrRNA（transactivating crRNA）和核酸內(nèi)切酶Cas9。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯起關(guān)鍵作用的是Cas9蛋白。crRNA通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)切斷雙鏈DNA[1]。在基因組編輯過(guò)程中，tracrRNA和crRNA可以融合成為1條引導(dǎo)RNA（sgRNA）[2]，具有和crRNA與tracr RNA配合使用的相同功能，但因?yàn)閟gRNA的結(jié)構(gòu)得到了簡(jiǎn)化，所以更方便研究者使用。CRISPR/Cas9操作簡(jiǎn)單，對(duì)基因組的效率高。要編輯某一個(gè)靶位點(diǎn)的時(shí)候，不用改造Cas9核酸酶，只需表達(dá)相應(yīng)的sgRNA就可對(duì)任何物種的基因組進(jìn)行高效率的定向編輯。

油菜素內(nèi)酯（BR）是植物界廣泛存在的一類植物激素[3]。研究表明，BR在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)、維管束分化、光形態(tài)發(fā)生、雄性生育能力、開(kāi)花、衰老和種子萌發(fā)等過(guò)程中都起著重要作用[4]。Wu等[5]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水稻BR缺失突變體表現(xiàn)為葉窄而直立、植株矮小，且產(chǎn)量明顯增加。Qian等[6]也進(jìn)一步在試驗(yàn)中證實(shí)缺少油菜素內(nèi)酯的brd3-D突變型水稻具有較矮的株型、較高的每穗粒數(shù)與結(jié)實(shí)率。Wu等研究表明在水稻根、莖、葉中特異性過(guò)量表達(dá)BR合成基因可以得到C22-羥化酶，從而提高水稻的分蘗數(shù)、灌漿率、每穗粒數(shù)、千粒重及產(chǎn)量。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)是以大田機(jī)械化及密集種植為前提的，油菜素內(nèi)酯能控制水稻節(jié)間長(zhǎng)度，從而降低植株高度，使植株更有利于進(jìn)行光合作用及機(jī)械化作業(yè)[7]。因此，缺失BR有利于改善水稻品性，提高水稻產(chǎn)量。

研究擬利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)定向敲除水稻基因組上BR降解相關(guān)的同源基因，首先構(gòu)建了4個(gè)水稻BR降解相關(guān)基因的CRISPR/Cas9敲除載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻中花11的愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)CRISPR/Cas9-BR基因的T0代水稻植株。提取轉(zhuǎn)基因水稻植株的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，與野生型序列進(jìn)行比對(duì)，獲得BR降解相關(guān)基因敲除的突變體植株，為突變體遺傳選育以及了解4個(gè)BR降解相關(guān)基因在水稻體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因和載體

試驗(yàn)BR降解相關(guān)的4個(gè)同源基因分別為CYP734A2、CYP734A5、CYP734A6和CYP734A4；最終載體PC1300-Cas9（圖1a）和中間載體SK-gRNA（圖1b）。供試水稻品種為水稻中花11。

圖1 試驗(yàn)所用的載體圖

1.2 引物合成

每個(gè)基因設(shè)計(jì)2個(gè)敲除位的引物，如表1所示，正向引物序列加GGCA，反向互補(bǔ)引物序列前加AAAC。

對(duì)獲得4個(gè)載體的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行編號(hào)，分別是LW23、LW24、LW25和LW26，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，如表2所示。

表1 4個(gè)BR降解相關(guān)的同源基因敲除載體的引物序列

1.3 CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建

1.3.1 引物退火和SK-gRNA酶切將8對(duì)引物的濃度稀釋到100 μmol/L，前引物和后引物各10 μL混合在一起，放入PCR儀中進(jìn)行退火[8]。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，85℃ 1 min，75℃ 1 min，65℃ 1 min，55℃ 1 min，45℃ 1 min，35℃ 1 min，25℃ 1 min，最后4℃條件下保存引物。用AarⅠ酶切SK-gRNA載體體系（100 μL），37℃酶切 3 h。

1.3.2 中間載體1和2的構(gòu)建首先將退火的8對(duì)引物分別與酶切后的中間載體SK-gRNA進(jìn)行連接，構(gòu)建成8個(gè)中間載體1。16℃條件下在PCR儀中運(yùn)行4 h或者在4℃條件下（冰箱）保存過(guò)夜。8個(gè)中間載體1分別進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、菌液培養(yǎng)及質(zhì)粒DNA提取。中間載體1分別編號(hào)為SKgRNA-A2-a，SKgRNA-A2-b，SKgRNA-A5-a，SKgRNA-A5-b，SKgRNA-A6-a，SKgRNA-A6-b，SKgRNA-A4-a，SKgRNA-A4-b。

表2 轉(zhuǎn)基因植株突變位點(diǎn)的鑒定引物

用BamHⅠ0.5 μL，KpnⅠ0.5 μL酶切8個(gè)中間載體1。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳條件為96 V，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物大小設(shè)定電泳時(shí)間，約40 min，待目標(biāo)產(chǎn)物跑至膠體一半時(shí)即可結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

在連接反應(yīng)體系[10×T4 Buffer 1μL，T4連接酶（ligise）1 μL，膠回收大片段 2 μL，膠回收小片段6 μL]下將酶切產(chǎn)物分別連接成為中間載體2。SKgRNA-A2-a和SKgRNA-A2-b連接產(chǎn)物編號(hào)為SKgRNA-A2-ab；SKgRNA-A5-a和 SKgRNA-A5-b連接產(chǎn)物編號(hào)為SKgRNA-A5-ab；SKgRNA-A6-a和SKgRNA-A6-b連接產(chǎn)物編號(hào)為SKgRNA-A6-ab；SKgRNA-A4-a和SKgRNA-A4-b連接產(chǎn)物編號(hào)為SKgRNA-A4-ab。16℃條件下在PCR儀中運(yùn)行4 h 或者在4℃條件下（冰箱）保存過(guò)夜。

1.3.3 終載體的構(gòu)建先用KpnⅠ和BglⅡ進(jìn)行4個(gè)中間載體2以及最終載體PC1300-Cas9的酶切，回收酶切產(chǎn)物。再用T4連接酶將目的片段與PC1300-Cas9載體連接，將構(gòu)建好的終載體送去測(cè)序公司測(cè)序以及酶切驗(yàn)證。

1.4 CRISPR/Cas9-BR降解相關(guān)基因轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織和植株再生

將含有CRISPR/Cas9-BR降解相關(guān)基因載體的農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)過(guò)夜，用菌液稀釋培養(yǎng)基R1（N6培養(yǎng)基+B5維生素+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+20 mg/L乙酰丁香酮）至OD值為0.6～0.8，侵染水稻的胚性愈傷組織15 min，期間不停晃動(dòng)，之后用濾紙吸干多余的菌液，放在鋪有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基R2（N6培養(yǎng)基＋B5維生素+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+4.0 g/Lphytalgel+20 mg/L乙酰丁香酮）上暗培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)后的胚性愈傷組織用含有500 mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水洗2次，用濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)接抗性選擇培養(yǎng)基R3（N6培養(yǎng)基+B5維生素+2 mg/L2.4-D+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L谷氨酰胺+30 g/L蔗糖+4.0 g/L phytalgel +500 mg/L頭孢霉素+50 mg/L潮霉素）上篩選3次。每15 d 繼代一次。3輪選擇后挑取抗性愈傷組織系，進(jìn)行編號(hào)，并轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基R4（N6培養(yǎng)基＋B5維生素+ 0.5 mg/L NAA +3 mg/L 6-BA+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L谷氨酰胺+30 g/L蔗糖+4.0 g/L phytalgel）上進(jìn)行分化培養(yǎng)，同時(shí)提取抗性愈傷組織系的DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率。胚性愈傷組織出現(xiàn)的綠點(diǎn)進(jìn)一步分化出不定芽，待不定芽長(zhǎng)到2～3 cm，轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基R5（1/2 N6培養(yǎng)基＋1/2 B5維生素+20 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂）上，待苗長(zhǎng)到10 cm，并有大量的根，移栽營(yíng)養(yǎng)缽成活后，再移至大田成活，收種[9]。

1.5 轉(zhuǎn)基因水稻植株的突變位點(diǎn)鑒定

轉(zhuǎn)CRISPR/Cas9-BR降解相關(guān)基因的水稻植株，分別編號(hào)為L(zhǎng)W23，LW24，LW25和LW26。其中，LW23轉(zhuǎn)入CRISPR/Cas9-A2載體，LW24轉(zhuǎn)入CRISPR/Cas9-A5載體，LW25轉(zhuǎn)入CRISPR/Cas9-A6載體，LW26轉(zhuǎn)入CRISPR/Cas9-A4載體。分別用表2的引物，對(duì)每個(gè)載體獲得的100株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增出的片段測(cè)序，將檢測(cè)結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出純合突變體、雜合突變體和野生型。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9-BR敲除載體的酶切驗(yàn)證

將CRISPR/Cas9-BR終載體中的PC1300-Cas9載體用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切，將酶切后回收的含有兩個(gè)gRNA的基因片段連接到最終載體上。同時(shí)，以PC1300-Cas9空載體和中間載體2作為對(duì)照。載體PC1300-Cas9的大小約為14 633 bp，雙酶切切掉的片段僅3 bp，所以空載體酶切后在電泳圖上應(yīng)該只會(huì)出現(xiàn)一條大小約為15 000 bp的條帶；中間載體經(jīng)雙酶切后，會(huì)出現(xiàn)兩條條帶，分別為大小約3 000 bp的條帶和含有2個(gè)gRNA的大小約1 000 bp的條帶；終載體酶切后，也會(huì)出現(xiàn)兩條條帶，分別為大小約15 000 bp的條帶和含有2個(gè)gRNA的大小約1 000 bp的條帶。根據(jù)凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示，說(shuō)明含有兩段目的序列的基因片段確實(shí)連接到終載體中。

圖2 PC1300-Cas9基因終載體酶切驗(yàn)證圖

2.2 轉(zhuǎn)CRISPR/Cas9-BR基因水稻植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

4個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化水稻中花11的愈傷組織，經(jīng)過(guò)2個(gè)月左右，獲得大量的分化綠點(diǎn)。在保證每個(gè)載體都能獲得一些突變的前提下，為了減少后續(xù)的繼代工作量，針對(duì)每個(gè)載體選取100株轉(zhuǎn)基因水稻小苗進(jìn)行煉苗移栽。從400株轉(zhuǎn)化植株上取葉片樣本，提取其基因組DNA，分別用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖3是LW23部分樣品擴(kuò)增的結(jié)果，共有395個(gè)樣本能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的條帶。將PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的DNA樣本及其相對(duì)應(yīng)的引物送往生物公司進(jìn)行測(cè)序。

圖3 LW23轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的突變位點(diǎn)鑒定

對(duì)395株轉(zhuǎn)化植株DNA序列的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，可以統(tǒng)計(jì)出轉(zhuǎn)基因水稻的突變位點(diǎn)，如表3所示，270株為野生型，即兩條染色體和參考序列一致；61株為雜合子，即一條染色體和參考序列一致，另一條發(fā)生缺失或插入的突變；64株為突變體，其中39個(gè)樣本為雜合突變體，即兩條染色體發(fā)了不同的突變（一條缺失，另一條插入），25個(gè)樣本為純合突變體，即兩條染色體均發(fā)生了相同的突變（都是插入或者缺失）（圖4）。所有材料的平均突變率為16.20%，突變率較高，但是4種材料的第二個(gè)位點(diǎn)均沒(méi)有發(fā)生突變。

從表3中還可以看出，CRISPR/Cas 9系統(tǒng)定向敲除LW26材料CYP734A4基因的效率最高，在100個(gè)樣本中，野生體35株，突變體41株，其中包括雜合突變體27株，純合突變體14株。計(jì)算出突變率高達(dá)41%，純合突變率也高達(dá)14%。轉(zhuǎn)CRISPR/Cas 9-BR降解相關(guān)基因LW26這個(gè)材料突變率極高，是未來(lái)進(jìn)行突變體表型分析的優(yōu)秀材料。LW24第一個(gè)位點(diǎn)的突變率也很高，總突變率高達(dá)23%。

表3 4個(gè)材料的轉(zhuǎn)化情況 （株）

3 討 論

利用CRISPR / Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除基因在水稻基因功能研究及育種領(lǐng)域早有應(yīng)用。Zhang 等[10]在兩個(gè)水稻亞種中設(shè)計(jì)了11個(gè)靶序列，在水稻胚性細(xì)胞第一次分裂前就有接近半數(shù)完成了目的基因的編輯，說(shuō)明CRISPR / Cas9系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用非常高效。針對(duì)水稻抗除草劑基因BEL，Xu等[11]設(shè)計(jì)了3個(gè)不同的gRNAs，進(jìn)行基因敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻植株的突變效率在2%～16%之間。中科院高彩霞實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除了水稻和小麥2種作物的OsPDS和TaMLO等5個(gè)基因[12]，其中，水稻中突變效率為4.0%～9.4%，在T0代獲得了水稻純合pds突變體，表現(xiàn)型為植株矮小并且白化，與預(yù)期相符[13]。首次證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠用于植物的基因組編輯。Feng等[14]通過(guò)偏好性優(yōu)化原核生物Cas9的密碼子，利用35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9進(jìn)行表達(dá)，在Cas9的C端添加核定位信號(hào)，在水稻上成功的實(shí)現(xiàn)了Cas9系統(tǒng)的定點(diǎn)突變；首先，利用OsU6-2啟動(dòng)子對(duì)sgDNA進(jìn)行驅(qū)動(dòng)，分別構(gòu)建載體，再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織，最終獲得了水稻的SPP、ROC5與YSA3個(gè)基因的定點(diǎn)突變。還有研究表明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)了OsBADH2基因的突變率為7.1%，OsPDS-SP1基因的突變率為9.4%，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體之后，有3個(gè)水稻基因（OsBADH2、OsMPK2以及Os02g23823）和一個(gè)小麥基因TaMLO，它們的突變率為26.5%～38%[15]?？傮w來(lái)看，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對(duì)水稻進(jìn)行基因序列的無(wú)選擇性編輯，有效地提高了研究效率，能夠通過(guò)基因序列的準(zhǔn)確編輯，更加快速地獲得具有優(yōu)良性狀的新品種。

圖4 DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)

利用水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)，該研究成功獲得轉(zhuǎn)CRISPR/Cas9-BR降解相關(guān)基因的水稻，其中轉(zhuǎn)基因材料LW26，基因發(fā)生的突變率高達(dá)41%，說(shuō)明利用CRISPR / Cas9成功獲得敲除水稻基因的突變體植株，為未來(lái)進(jìn)行突變體功能驗(yàn)證提供了材料。對(duì)此突變體的試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果為BR降解相關(guān)基因功能喪失，油菜素內(nèi)酯在水稻體內(nèi)大量積累。另外，從純合的轉(zhuǎn)CRISPR/Cas9-BR降解相關(guān)基因突變體的表型上看，與野生型發(fā)生了一些較為明顯的區(qū)別，主要有葉夾角變大，種子變大等。另外，轉(zhuǎn)CRISPR/Cas9-BR基因突變體水稻在產(chǎn)量相關(guān)的表型上的變化，如千粒重、每穗粒重，每株穗數(shù)、株高、分蘗數(shù)等也是今后表型分析的重點(diǎn)研究方向[16]。

4 結(jié) 論

該研究將水稻BR降解相關(guān)基因的4個(gè)同源基因CYP734A2、CYP734A5、CYP734A6和 CYP734A6分別設(shè)置了2個(gè)敲除位點(diǎn)，通過(guò)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BglⅡ和BamHⅠ，進(jìn)行3次連接反應(yīng)，2次酶切反應(yīng)，經(jīng)過(guò)中間載體SK-gRNA，最終將這4個(gè)同源基因的靶序列構(gòu)建到終載體PC1300-Cas9中，用于轉(zhuǎn)化水稻植株。通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合測(cè)序結(jié)果分析，在395株P(guān)CR檢測(cè)呈陽(yáng)性的水稻轉(zhuǎn)化植株中，得到25株轉(zhuǎn)CRISPR/Cas 9-BR基因的純合突變體。同時(shí)，篩選到轉(zhuǎn)CRISPR/Cas 9-BR降解相關(guān)基因突變效率極高的水稻材料LW26。得到了14株純合突變體和27株雜合突變體，為下一步進(jìn)行突變體表型分析提供了有力的理論依據(jù)，為今后探究BR基因在水稻中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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Rice (Oryza sativa) BR Degradation Related Genes Knockout by CRISPR/Cas9 Technology

YE Zhao-nan1,2，HE Lu1，ZHANG Lin-lin1，LI Fei-fei1，LIU Wen-zhen2
（1. Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an 311300, PRC; 2. National Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Fuyang 311400, PRC）

Brassinolide (BR) as a common plant hormone plays an important regulation role in the growth and development of plants, especially in the rice plant type improvement and stress resistance. In this study, CRISPR/Cas9 knockout carriers of four rice BR degradation related genes were constructed, then the carriers of the four genes were transformed into rice (Oryza sativa L.) via Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of rice variety Zhonghua 11 callus, and 395 transgenic plants were obtained after the callus was screened, each carrier with 50 mg/L hygromycin as a screening marker; and PCR product was amplified with the primers on both sides of the target site and sequenced. The results showed that the 395 transgenic plants included 270 plants belonging to wild type, 61 to heterozygote type and 64 to mutant type. Of the 64 mutants, 39 were heterozygous mutants and 25 were homozygous mutants, and the frequency of homozygous mutation is 6.25%. The mutant alleles were found in all the four genes, but the mutation efficiencies of different genes were different; and among them, the mutation frequency of the LW26 transgenic plants was 41%. These transgenic plants could be used as a foundation for the breeding of homozygous progeny and the identification of mutation expression in the future.

rice; BR related gene; CRISPR/Cas9 system; genetic transformation; target site identification

Q943.2

A

1006-060X（2017）09-0001-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.001

2017-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31401461）；2016年浙江農(nóng)林大學(xué)校級(jí)教改項(xiàng)目（KG16001）；2017年浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目（113-2013200060）

葉照楠（1996-），女，浙江臺(tái)州市人，本科生，農(nóng)學(xué)專業(yè)。

李飛飛，劉文真

（責(zé)任編輯：成 平）