王洪梅 李春明 白卉 周志軍 王艷敏

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱，150081)

一種鑒定山楊性別的SSR分子標(biāo)記的篩選1)

王洪梅 李春明 白卉 周志軍 王艷敏

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱，150081)

為了對(duì)山楊的幼苗進(jìn)行早期的性別鑒定，通過(guò)尋找與楊屬性別染色體相關(guān)的分子標(biāo)記，試著鑒定山楊的雌雄。采用SSR結(jié)合BSA技術(shù)對(duì)96個(gè)山楊個(gè)體(雌性各48個(gè))進(jìn)行性別差異標(biāo)記的篩選，發(fā)現(xiàn)1對(duì)引物(BPCA90)在雄基因池?cái)U(kuò)增出差異條帶。利用引物BPCA90檢測(cè)待測(cè)樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記基因型，若檢測(cè)得到長(zhǎng)度約550 bp的單一片段為雄性，未檢測(cè)到長(zhǎng)度約550 bp的單一片段為雌性，從而完成對(duì)山楊的雌雄性別的鑒別。整個(gè)鑒定過(guò)程操作簡(jiǎn)單，方法鑒別率為100%，且得到條帶結(jié)果清晰、鑒定過(guò)程特異性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)。

山楊；性別鑒定；SSR

山楊(Populusdavidiana. Dode)是我國(guó)廣泛分布的鄉(xiāng)土樹種之一[1]，屬于白楊派山楊組,是重要先鋒樹種和山地造林樹種。山楊材質(zhì)優(yōu)良，早期速生，是東北林區(qū)主要采伐樹種。由于幼葉呈粉紅色至鮮紅色，山楊也可作為觀賞樹種[2]。因?yàn)樯綏畲浦觑w絮不適合城鄉(xiāng)綠化,所以綠化品種應(yīng)選擇山楊雄株。但是，山楊早期性別通過(guò)外部形態(tài)特征很難進(jìn)行鑒定，只有在花果期才能進(jìn)行準(zhǔn)確的性別鑒定。本研究利用的SSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)尋找與楊屬性別染色體相關(guān)的分子標(biāo)記，鑒定山楊的雌雄，為山楊早期性別鑒定及育種工作提供輔助手段，縮短山楊綠化新品種的選育周期。此外，山楊幼株的性別鑒定有助于對(duì)山楊種群的性比格局及空間分布[3]、山楊性別因素對(duì)植株徑向生長(zhǎng)及氣候因子關(guān)系的影響等問(wèn)題的輔助研究[4]。本研究成果已申請(qǐng)專利并授權(quán)。

1 材料與方法

樣本采集：96個(gè)山楊(雌雄各48個(gè)體)采自黑龍江省林口縣青山林場(chǎng)的山楊種源家系保存林，摘取新鮮、無(wú)病蟲害短枝的第一片幼嫩葉片，注明性別，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室用于DNA提取。

DNA提?。翰捎帽本┣f盟國(guó)際生物基因科技有限公司生產(chǎn)的ZP309-3植物基因組DNA提取試劑盒提取楊樹總DNA，在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)其DNA樣品的濃度和純度。用ddH2O稀釋至50 mg/L左右。

BSA基因池的建立：根據(jù)混合分離群體分析法(BSA)原理[5]，隨機(jī)選擇雌雄個(gè)體各10個(gè)，各吸取20 μL DNA溶液混勻，組成雌雄基因池。

SSR引物的篩選與合成：根據(jù)文獻(xiàn)查找與楊屬性別相關(guān)的SSR分子標(biāo)記的引物共26對(duì)。其中ORPM_206、ORPM_276、PMGC_2702、ORPM_432與黑楊(PopulusnigraL.)性別相關(guān)的4對(duì)SSR引物來(lái)源于[16]；GCPM_79、GCPM_249、GCPM_1917、GCPM_249、GCPM_2319、GCPM_604、GCPM_4063、GCPM_1278、GCPM_1131、GCPM_4000、GCPM_831、ORPM_277、ORPM_263、GCPM_2829、ORPM_433、GCPM_204、GCPM_2803與楊屬(Populus)性染色體相關(guān)的17對(duì)引物來(lái)源于[7]；BPGGG82、BPCA90、BPTG50、BPTTG60、BPTC66與歐洲山楊(Populustremula)×美洲山楊(Populustremuloides)性染色體相關(guān)的5對(duì)引物來(lái)源于[8]。所有引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR及電泳：PCR反應(yīng)總體系為25 μL，含有10×Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶0.5 U，模板DNA 50 ng左右。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離，于0.5 mg/L EB染色，凝膠成像儀拍攝保存。

差異條帶的篩選與驗(yàn)證：采用26對(duì)SSR引物對(duì)所構(gòu)建的山楊雌雄基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR電泳圖譜，初步查找雌雄兩個(gè)群體的差異性條帶，對(duì)有差異的引物按照上述PCR條件對(duì)構(gòu)建雌雄基因池的10個(gè)山楊個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析有差異的等位基因片段在個(gè)體上具體的擴(kuò)增情況，對(duì)差異條帶進(jìn)行24個(gè)山楊個(gè)體的驗(yàn)證，然后用其余的72個(gè)個(gè)體進(jìn)行同樣的操作，進(jìn)一步驗(yàn)證該引物鑒定山楊雌雄的準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA分池PCR擴(kuò)增結(jié)果

用26對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)所構(gòu)建的雌雄基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，26對(duì)引物中，發(fā)現(xiàn)有2對(duì)(BPTG50和BPCA90)引物擴(kuò)增出的差異條帶均出現(xiàn)在雄性基因池里，部分電泳結(jié)果如圖1。

隨機(jī)選取山楊雌雄植物各5株用這兩個(gè)差異引物(BPTG50和BPCA90)做進(jìn)行一步個(gè)體分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物BPCA90在雌雄個(gè)體上出現(xiàn)差異，若檢

測(cè)得到長(zhǎng)度為550 bp的單一片段為雄性，未檢測(cè)到550 bp的單一片段為雌性，如圖2。

1、2道為引物GCPM_2829，3、4道為引物BPTC66，5、6道為引物BPTTG60，7、8道為引物BPTG50，9、10道為引物BPCA90；1、3、5、7、9為雌性基因池，2、4、6、8、10為雄性基因池；M.DS 2 000。

圖1部分引物對(duì)山楊雌雄基因池篩選結(jié)果

泳道1～5.雌性個(gè)體；6～10.雄性個(gè)體；M.DS 2000；箭頭是雄性特異片段。

圖2引物BPCA90對(duì)山楊單株DNA擴(kuò)增的結(jié)果

2.2 差異等位基因片段在山楊個(gè)體中的驗(yàn)證

將BSA池中篩選到的1對(duì)引物首先在構(gòu)建基因池的24個(gè)個(gè)體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)24個(gè)山楊(雌雄各12個(gè)個(gè)體)個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證，能100%的區(qū)別山楊雌雄個(gè)體，若檢測(cè)得到長(zhǎng)度為550 bp的單一片段為雄性，未檢測(cè)到550 bp的單一片段為雌性。如圖3，1～12個(gè)雌性個(gè)體在這個(gè)位點(diǎn)上沒(méi)有條帶，13～24個(gè)雄性個(gè)體上都出現(xiàn)了條帶。

M.DS 2000分子標(biāo)記；1～12為雌性個(gè)體；13～24為雄性個(gè)體。

進(jìn)一步對(duì)余下的72個(gè)山楊雌雄個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物BPCA90的差異條帶在所有的雌性個(gè)體中未擴(kuò)增出來(lái)，而在所有的雄性個(gè)體中都擴(kuò)增出來(lái)，與第一輪的24個(gè)山楊個(gè)體驗(yàn)證的結(jié)果相同(圖4)。

3 討論

本研究所使用的引物來(lái)源于參考文獻(xiàn)[8]，該文主要研究了歐洲山楊和美洲山楊雜交的連鎖群XIX的基因圖譜和性連鎖SSR標(biāo)記的鑒別。選取歐洲大葉楊的SSR標(biāo)記對(duì)130個(gè)歐洲山楊和美洲山楊的雜交株的連鎖群XIX進(jìn)行基因圖譜的制作。該文主要提供了一種楊樹雜交株性連鎖群XIX的基因圖譜的制備方法，SSR引物在該文中的作用是為了實(shí)現(xiàn)遺傳圖譜的制作，該文主要研究的是雄性和雌性植株性遺傳圖譜上性基因的位置關(guān)系，SSR標(biāo)記的使用是為了實(shí)現(xiàn)基因更精準(zhǔn)的定位，文中并沒(méi)有公開其中哪些或那對(duì)引物能夠用于楊樹性別的鑒定。本研究利用該文提供的引物(BPCA90)進(jìn)行PCR反應(yīng)，若檢測(cè)得到長(zhǎng)度約550 bp的單一片段，則為雄性，若未檢測(cè)到長(zhǎng)度約550 bp的單一片斷，則為雌性。本研究將引物BPCA90F和BPCA90R應(yīng)用于山楊性別的鑒定中，該方法具有鑒別率100%、快速、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了山楊雌雄幼株性別的鑒定。

M.DS 2000分子標(biāo)記；1～12為雌性個(gè)體；13～24為雄性個(gè)體;25～36為雌性個(gè)體；37～48為雄性個(gè)體;49～60為雌性個(gè)體；61～72為雄性個(gè)體。

目前為止，用微衛(wèi)星DNA序列標(biāo)記進(jìn)行雌雄異株早期性鑒定的研究還比較少。Parasnis et al.[9]用微衛(wèi)星(GATA)4探針鑒定了番木瓜1個(gè)5kb的特異條帶僅出現(xiàn)在雄株中，表明微衛(wèi)星標(biāo)記可以鑒定番木瓜的雌雄，并發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記進(jìn)行早期性別鑒定的準(zhǔn)確率達(dá)到100%，與本研究在文獻(xiàn)[8]中找到的與山楊性染色體相關(guān)的SSR標(biāo)記所獲得鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到100%的結(jié)果是一致的。最近，表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了一個(gè)巨大的有價(jià)值的來(lái)源，避免了傳統(tǒng)SSR引物在開發(fā)時(shí)費(fèi)用高的問(wèn)題。EST-SSR標(biāo)記保守性質(zhì)與基因組SSR標(biāo)記相比在物種之間具有更高通用性[10]。林開勤等[11]利用140對(duì)EST-SSR引物篩選出了1個(gè)與杜仲雄株性別相關(guān)的引物EST-Eu059，鄧傳良等[12]利用EST-SSR引物序列從菠菜雄性基因組中擴(kuò)增出一條分子量為200b左右的特異性條帶，與本研究在雄性山楊中發(fā)現(xiàn)特異性條帶是一致的，說(shuō)明利用基于表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)開發(fā)SSR引物進(jìn)行植物性別鑒定是可行的。齊鳳慧等利用EST-SSR引物序列經(jīng)3輪篩選，選出2對(duì)引物用于200棵水曲柳雌雄鑒定，雌雄差異率分別64.5%和89.5%[13],雌雄辨別率沒(méi)用達(dá)到100%，可能需要進(jìn)一步開發(fā)SSR引物，研究雄性和雌性植株性遺傳圖譜上性基因的位置關(guān)系，實(shí)現(xiàn)基因更精準(zhǔn)的定位。隨著SSR標(biāo)記的開發(fā)成本的降低，利用SSR引物對(duì)雌雄植株的性染色體進(jìn)行更精準(zhǔn)定位，只要引物確定，其性別早期鑒定結(jié)果是極為穩(wěn)定和可靠的，這一方法可以應(yīng)用于多年生經(jīng)濟(jì)物種的早期性別鑒定。

4 結(jié)論

本研究篩選出了一個(gè)與山楊雄株性別相關(guān)的SSR標(biāo)記BPCA90，該引物正向序列為5′-CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC-3′，反向序列為5′-GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC-3′。應(yīng)用該標(biāo)記能夠在山楊開花前檢測(cè)其性別，整個(gè)操作簡(jiǎn)便快捷，鑒別率為100%，且得到條帶結(jié)果清晰、特異性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，為山楊雌、雄植株的合理利用提供了技術(shù)保障，從而提高山楊資源利用率。

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ScreeningSSRMarkersforSexIdentificationinPopulusdavidianaDode

//Wang Hongmei, Li Chunming, Bai Hui, Zhou Zhijun, Wang Yanmin

(Forestry Research Institute of Heilongjiang Province, Harbin 150081, P. R. China)

In order to identify the sex inPopulusdavidianaDode seedlings, we identified male and female ofP.davidianaDode by searching sex chromosome-correlated markers inPopulus. Microsatellites combined with bulked segregation analysis (BSA) were used to screen the gender differences of 96 individuals (48 for male and female each) inP.davidianaDode, specific DNA fragments of male gene pool were amplified by 1 pairs of primers (BPCA90). A specific fragment of about 550 bp was obtained from the male plant through nested PCR using primer BPCA90 to amplify the genomic DNA abstracted from the leaves of male and female trees. The whole appraisal process operation simple, the method accuracy was 100%, and bands are clear with appraisal process high specificity, good repeatability, and strong stability.

PopulusdavidianaDode； Sex identification； SSR

1)黑龍江省森林工業(yè)總局應(yīng)用研究項(xiàng)目(sgzjY2014007)。

王洪梅，女，1979年9月生，黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，副研究員。E-mail：wanghm1979@126.com。

李春明，黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，副研究員。E-mail：lichunming_lcm@163.com。

2017年4月13日。

責(zé)任編輯：潘 華。

S792.11

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(10)：17-19,29.

1)河南省基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目(162300410157)；河南省教育廳重點(diǎn)研究項(xiàng)目(17A21005)。

第一作者簡(jiǎn)介：張少偉，男，1981年10月生，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，博士研究生；現(xiàn)工作于河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝園林學(xué)院，講師。E-mail:hncazsw@126.com。