沈佳雯，樊丹平，邱雪梅，呂愛平，何小鵑，耿 耘＊＊

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院成都610031；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京 100700；3.香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 香港 999077）

白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的作用研究＊

沈佳雯1，樊丹平2，邱雪梅1，呂愛平3，何小鵑2，耿 耘1＊＊

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院成都610031；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京 100700；3.香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 香港 999077）

目的：觀察白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細(xì)胞NOD樣受體-3（NLRP3）炎癥小體的影響。方法：用佛波酯（PMA）（10 ng·mL-1）刺激U937細(xì)胞48 h，誘導(dǎo)其成為巨噬細(xì)胞，觀察不同劑量白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物（0，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg·mL-1）對細(xì)胞活力的作用，并選擇合適的濃度。采用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）和免疫印跡法（Western blot）測定細(xì)胞中NLRP3，半胱天冬酶-1（caspase-1）的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素（IL）-1β的含量。結(jié)果：細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)藥物濃度低于25 μg·mL-1時(shí)，對細(xì)胞活力沒有影響，當(dāng)藥物濃度高于50 μg·mL-1時(shí)，對細(xì)胞活力有抑制作用（P＜0.05），選擇25 μg·mL-1濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與空白組相比，LPS組細(xì)胞中NLRP3，caspase-1表達(dá)明顯增加（P＜0.01），細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β濃度也明顯增高（P＜0.01）。白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物作用后，NLRP3，caspase-1，IL-1β表達(dá)均明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論：白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體有抑制作用。

炎癥小體 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物 NLRP3 caspase-1 IL-1β

潰瘍性結(jié)腸炎是以局部黏膜的潰瘍、出血、糜爛為主要表現(xiàn)的慢性非特異性炎性自身免疫病[1]，目前仍然缺乏有效治療藥物。研究顯示，巨噬細(xì)胞在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，可通過分泌IL-1β等破壞腸黏膜屏障的細(xì)胞因子從而影響炎癥的發(fā)展方向[3]。NLRP3炎癥小體是巨噬細(xì)胞中參與炎癥反應(yīng)的重要組成部分，現(xiàn)代研究證明其參與維持了腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。一方面，腸內(nèi)病原體等不良因素可以激活NLRP3炎性體，激發(fā)腸道固有免疫發(fā)揮屏障防御作用；另一方面，炎性體的激活可導(dǎo)致IL-1β家族炎性因子分泌過多，加重腸黏膜炎癥反應(yīng)造成腸道損傷[4]。

白術(shù)黃芪湯最早出自《劉河間醫(yī)學(xué)六書·素問病機(jī)氣宜保命集·瀉痢論·卷十九》，根據(jù)原文所述，“白術(shù)黃芪湯，服前藥，痢雖已除，猶宜此藥和之?！仔g(shù)一兩，黃芪七錢，甘草三錢”。近年來，已有多篇報(bào)道證實(shí)白術(shù)黃芪湯對潰瘍性結(jié)腸炎有治療作用，且有一定的抗炎作用[5,6]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)：白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物能夠抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)。上述研究提示白術(shù)黃芪湯能夠抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用，然而，其是否通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體抑制巨噬細(xì)胞炎性因子的釋放目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)以人單核巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞為研究對象，以NLRP3炎癥小體為切入點(diǎn)，采用體外培養(yǎng)方法，構(gòu)建體外炎癥模型，探究白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物治療潰瘍性結(jié)腸炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物由奧地利格拉茨大學(xué)Rudolf Bauer教授提供；U937細(xì)胞（購自北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibcol公司，22400089）；胎牛血清（美國Gibcol公司，10099141）；雙抗（美國Gibcol公司，15070063）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國HyClone公司，SH30256.01B）；脂多糖（美國Sigma公司，L-2880）；佛波酯（PMA）（美國Sigma公司，P1585）；CCK-8檢測試劑盒（日本DOjinDO公司，CK04）；TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司，DP405-02）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本 TaKaRa公司，RR047A）；SYBR?Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）（日本TaKaRa公司，RR420A）；β-actin抗體（英國abcam公司，ab8227）；NLRP3抗體（abcam，ab214185）；Caspase-1抗體（英國abcam公司，ab1872）；RIPA裂解液（強(qiáng)）（碧云天生物技術(shù)，P0013）；蛋白酶抑制劑PMSF（碧云天生物技術(shù)，ST506-2）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）（碧云天生物技術(shù)，P0010）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)，P0012A）；人IL-1βELISA試劑盒（美國eBioscience公司，BMS224/2）。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；酶標(biāo)分析儀（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國sigma公司,Laboratory Centrifuges 3K15）；電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，XMTD-204）；生物安全柜（Thermo Scientific，MSC-ADVANTAGE）；渦旋震蕩儀（其林貝爾儀器制造有限公司，QL-902）；熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems，AB17500）；制冰機(jī)（美國Thermo公司，F(xiàn)orma-86CULT）；蛋白核算凝膠成像系統(tǒng)（昊特偉業(yè)科技有限公司，F(xiàn)luor Chem FC2）；電泳儀（美國 Bio-Rad公司，A101439）；電泳槽（美國Bio-Rad公司，1658003）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

U937細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，換液方式為半保留換液，每2天傳代一次。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測

實(shí)驗(yàn)取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，加入終濃度為10ng·mL-1的PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄上清，加入含不同濃度藥物的新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)置7個(gè)組：0，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg·mL-1組，每組做3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL CCK-8，再培養(yǎng)3 h后，450 nm處檢測吸光度值。

1.3.3 給藥實(shí)驗(yàn)

選擇對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105mL-1接種于6孔板，每孔2 mL，加PMA誘導(dǎo)48 h使其成長為巨噬細(xì)胞后，吸棄全部上清液，用PBS沖洗兩遍，LPS組和白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物給藥組加入2 mL含LPS（1 μg·mL-1）的培養(yǎng)基，空白組加入2 mL RPMI1640，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中作用2 h后，給藥組加入合適濃度的白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞上清和細(xì)胞，以備檢測。

1.3.4 RT-PCR檢測細(xì)胞中NLRP3，caspase-1的表達(dá)

總RNA提取按照TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行。提出的RNA在測定濃度后，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒中的說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以cDNA為模板配置PCR反應(yīng)體系，以內(nèi)參β-actin作對照。所需引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為：NLRP3-F：CATGAGTGCTGCTTCGACAT，NLRP3-R：GCTTCAGTCCCACACACAGA，caspase-1-F：GCTTTCTGCTCTTCCACACC，caspase-1-R：TCCTCCACATCACAGGAACA，βactin-F：CTGGGACGACATGGAGAAAA，β-actin-R：AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，退火60℃，10 s，共40個(gè)循環(huán)，延伸95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 °C，15 s。

1.3.5 Westernblot檢測細(xì)胞中NLRP3，caspase-1的表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF上，用含5%脫脂奶粉的1×TBST封閉。分別加入NLRP3，caspase-1，β-actin一抗，孵育過夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗）。暗室內(nèi)ECL發(fā)光法檢測目的條帶，膠片曝光，顯影，以β-actin為內(nèi)參分析結(jié)果。

1.3.6 ELISA檢測細(xì)胞上清中IL-1β的含量

將收集到的細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀測450 nm處的吸光度（A450）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和A值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本A值對應(yīng)的濃度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（xˉ±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8法檢測白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對U937細(xì)胞的活力作用，確定白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物的給藥濃度。如圖1所示，與0 μg·mL-1相比，當(dāng)藥物濃度低于25 μg·mL-1時(shí)，對細(xì)胞活力沒有影響，當(dāng)藥物濃度高于50 μg·mL-1時(shí)，對細(xì)胞活力有抑制作用（P＜0.05）。所以選擇25 μg·mL-1白術(shù)黃芪湯作為最佳藥物濃度。

2.2 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細(xì)胞NLRP3，caspase-1 mRNA表達(dá)的影響

圖2顯示，經(jīng)LPS刺激后，巨噬細(xì)胞中NLRP3和caspase-1的mRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物作用后，NLRP3和caspase-1的mRNA水平均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細(xì)胞NLRP3，caspase-1蛋白表達(dá)的影響

圖3顯示，與空白組相比，LPS組中NLRP3，caspase-1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與LPS組相比，給藥組中NLRP3，caspase-1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

2.4 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細(xì)胞上清中IL-1β的影響

采用ELISA法檢白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細(xì)胞上清中IL-1β的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比（296.73±10.52），LPS組IL-1β含量較高（1277.63±19.21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與LPS組相比，給藥組細(xì)胞上清中的IL-1β表達(dá)（693.59±27.93）顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

圖1 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細(xì)胞活力的影響

圖2 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對細(xì)胞NLRP3，caspase-1 mRNA表達(dá)的影響

白術(shù)黃芪湯是金元醫(yī)家劉完素用于治療濕熱痢疾恢復(fù)期的方藥，由白術(shù)、黃芪、甘草三味藥按照10∶7∶3的比例組方而成?，F(xiàn)代研究顯示，白術(shù)乙酸乙酯部位是其活性組分群，包含雙白術(shù)內(nèi)酯、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ等有效活性成分[7]，可以抗腫瘤[8]，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[9]；黃芪乙酸乙酯部位中含有較多黃酮類物質(zhì)[10]，在免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤方面有重要作用[11]。研究顯示，甘草乙酸乙酯部位中的總黃酮有顯著的抗炎效果[12]；白術(shù)黃芪湯原方為水煎劑，其乙酸乙酯提取物提取工藝簡便、成本低，通過深入研究，將其研制成抗炎新藥具有研究價(jià)值和應(yīng)用前景，同時(shí)為了提高療效并探討白術(shù)黃芪湯抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究選用白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物。

圖3 白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對細(xì)胞NLRP3，caspase-1蛋白表達(dá)的影響

炎癥小體通過招募半胱天冬酶-1前體（procaspase-1）并使2個(gè)相鄰的pro-caspase-1發(fā)生自身水解，產(chǎn)生具有酶活性的caspase-1，介導(dǎo)IL-1β等炎癥因子由前體形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问剑置诘桨獍l(fā)揮生物學(xué)功能[13]。越來越多的研究表明：NLRP3與潰瘍性結(jié)腸炎之間有著密切的關(guān)系，炎癥小體的激活可導(dǎo)致炎性因子分泌過多，加重腸黏膜炎癥反應(yīng)，最終造成腸道損傷。相關(guān)研究證明：白術(shù)黃芪湯治療潰瘍性結(jié)腸炎作用明顯，能夠降低相關(guān)的炎性因子[14]，而NLRP3炎癥小體是炎癥調(diào)節(jié)的核心，提示白術(shù)黃芪湯有可能通過NLRP3炎癥小體治療潰瘍性結(jié)腸炎。

本研究結(jié)果提示：利用LPS刺激巨噬細(xì)胞，建立體外炎癥模型，并用白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)藥物能夠顯著降低炎性巨噬細(xì)胞NLRP3，caspase-1的表達(dá)，同時(shí)能夠抑制細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β，提示白術(shù)黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體有抑制作用。由于體外實(shí)驗(yàn)在準(zhǔn)確反映體內(nèi)環(huán)境方面存在一定局限，本研究只是用該實(shí)驗(yàn)方法得到初步的觀察結(jié)果，還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步探索。該研究可作為相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，這也為白術(shù)黃芪湯治療潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

致謝：感謝奧地利格拉茨大學(xué)Prof.Rudolf Bauer課題組為本課題提供相關(guān)藥品。

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Effects of Bai-Zhu Huang-Qi Decoction Extract on NLRP3 Inflammasome in Macrophages

Shen Jiawen1,Fan Danping2,Qiu Xuemei1,Lv Aiping3,He Xiaojuan2,Geng Yun1
(1.School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University,Chendu 610031,China;2.Institute of Basic Research in Clinical Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;3.School of Chinese Medicine of Hong Kong Baptist University,Hong Kong 999077,China)

This study was aimed to observe the effect ofBai-Zhu Huang-Qi(BZHQ)decoction ethyl acetate extract on NOD like receptor family,pyrin domain-containing 3(NLRP3)inflammasome in macrophages.The U937 cells were pretreated with phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA,10 ng·mL-1)for 48 hours to induce macrophages.Effects on cell viability by different doses of BZHQ decoction ethyl acetate extract(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100 μg·mL-1)were observed to select the appropriate concentration.Contents of NLRP3 and caspase-1 in cells were detected by real-time PCR and western blot.The concentration of interleukin-1β(IL-1β)in cell supernatant was detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The cell counting kit-8(CCK-8)assay showed that when the drug concentration was lower than 25 μg·mL-1,there was no impact on cell viability;when the drug concentration was higher than 50 μg·mL-1,there was inhibition on cell viability(P＜ 0.05).The concentration of 25 μg·mL-1was used to conduct the following experiment.Compared to the blank group,the expression of NLRP3 and caspase-1 in cells of the LPS group were significantly increased(P＜0.01).The concentration of IL-1βin cell supernatant was also significantly increased(P＜0.01).After treated with BZHQ decoction ethyl acetate extract,levels of NLRP3,caspase-1 and IL-1βwere significantly decreased(P＜0.05).It was concluded that BZHQ decoction ethyl acetate extract can inhibit the production of NLRP3 inflammasome in LPS-stimulated macrophages.

Inflammasome,Bai-Zhu Huang-Qidecoction ethyl acetate extract,NLRP3,caspase-1,IL-1β

10.11842/wst.2017.08.019

R33

A

2017-04-20

修回日期：2017-07-20

＊ 國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2014DFG32700）：中醫(yī)藥對慢性疾病的預(yù)防與早期干預(yù)的合作研究，主持人：劉保延。

＊＊ 通訊作者：耿耘，研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥作用機(jī)理工作。何小鵑，副研究員，主要研究方向：中藥免疫藥理研究。

（責(zé)任編輯：郭嫦娥，責(zé)任譯審：王 晶）