劉志聰，張振霞，賴 宣，楊啟財(cái)，陸玉婷，黃秋轉(zhuǎn)，鄭玉忠＊＊

（1.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院 廣東潮州 521041；2.廣東濟(jì)公保健食品有限公司 廣東潮安 515638）

潮州老香黃的HPLC指紋圖譜研究及指標(biāo)成分測(cè)定＊

劉志聰1，張振霞1，賴 宣2，楊啟財(cái)2，陸玉婷1，黃秋轉(zhuǎn)1，鄭玉忠1＊＊

（1.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院 廣東潮州 521041；2.廣東濟(jì)公保健食品有限公司 廣東潮安 515638）

目的：潮州老香黃是佛手的炮制品，本文以不同產(chǎn)地的老香黃為研究對(duì)象，建立了老香黃的HPLC指紋圖譜，并測(cè)定了橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量，為建立潮州老香黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。方法：色譜條件為Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相：流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫。流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。結(jié)果：得到分離度、重現(xiàn)性均較好的老香黃HPLC指紋圖譜，對(duì)27批老香黃樣品進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示老香黃的指紋圖譜有一定的相似性，但整體有一定的差異。同步測(cè)定了老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量。結(jié)論：本文建立的老香黃指紋圖譜及橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素含量測(cè)定的方法針對(duì)性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，為潮州老香黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

老香黃 佛手 HPLC指紋圖譜 橙皮苷 5,7-二甲氧基香豆素

潮州老香黃(也稱老香櫞、佛手香黃)是潮汕特有的保健和藥用制品，由蕓香科植物佛手(Citrus medicaL.VarSarcodactylis(Noot)Swingle)的果實(shí)炮制而成的。佛手具有理氣、化痰、治療胃痛、腹脹、嘔吐、祛痰鎮(zhèn)咳及解酒等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，也是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“藥食兩用”中藥之一，但本身味道苦辛，不宜直接食用[1-2]，為此，潮汕人以佛手柑為原料，經(jīng)過(guò)鹽腌、曬干、炊熟、浸中藥粉液等步驟，經(jīng)歷九蒸九曬制成了色黑如漆、綿軟的老香黃[3]。制好的老香黃具有去積祛風(fēng)、開(kāi)胃理氣、化痰生津等功效，而且久藏不壞，貯藏時(shí)間越長(zhǎng)藥效越佳，身價(jià)也就越高。因此，老香黃是潮汕家庭必備的藥用涼果，具備良好的開(kāi)發(fā)潛力。

潮州老香黃的主要原料是廣佛手和金華佛手，這兩種佛手的生長(zhǎng)環(huán)境和化學(xué)成分各不同[4-5]。佛手中含有多種揮發(fā)性成分，主要包括橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素等[6]。其中橙皮苷具有抗氧化、抗炎、止痛、降壓降血脂等活性，還有抑制水腫、出血、抗癌等效果[7-8]；香豆素則有抗HIV、抗癌、降壓、抗心律失常、抗骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛、平喘及抗菌等多方面生物學(xué)活性，具有潛在的藥用價(jià)值[9-10]。同時(shí)，目前老香黃多以作坊制作為主，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的制備方法，導(dǎo)致老香黃成品在化學(xué)成分組成及含量上差異很大，因而直接影響到老香黃的質(zhì)量。因此，建立老香黃的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，控制其質(zhì)量，對(duì)于老香黃臨床合理、安全應(yīng)用具有重要意義。本研究利用HPLC法對(duì)潮州地區(qū)不同的老香黃進(jìn)行系統(tǒng)研究，首次建立了老香黃的色譜指紋圖譜，并對(duì)老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素兩個(gè)活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，為老香黃藥材全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

美國(guó)Aglient 1200高效液相色譜儀(四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、自動(dòng)脫氣機(jī)、DAD檢測(cè)器、Aglient1200色譜工作站)；DP-01真空泵（天津東康科技有限公司）；FA2004電子天平 (上海精科)；KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗儀（昆明市超聲儀器有限公司）；UV-2800型紫外可見(jiàn)分光光光度計(jì)（龍尼科上海儀器有限公司）；GenPure超純水系統(tǒng)純水器（德國(guó)TKA公司）。

1.2 試劑

乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）、甲醇（分析純，西隴化工股份有限公司）、磷酸（西隴化工股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 藥品

對(duì)照品橙皮苷（購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，批號(hào)為05-1009，純度＞98%）和5,7-二甲氧基香豆素（購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為11-1207，純度＞98%）。

2012年5月至8月，27批老香黃樣品包含分別購(gòu)自廣東省潮州市等不同產(chǎn)地，所有樣品均為佛手的加工品，樣品編號(hào)為1號(hào)～27號(hào)。所有樣品均保存于韓山師范學(xué)院生物學(xué)系。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取取橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素對(duì)照品各2.5 mg，精密稱定，用甲醇溶解后，并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得濃度為100 mg·L-1的橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液的制備

將27批老香黃樣品分別進(jìn)行干燥和粉碎，分別精密稱取1 g的老香黃樣品，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，玻璃棒研磨，稱定重量，45℃超聲處理30 min（500 W），用甲醇補(bǔ)足重量，0.45 μm濾膜濾過(guò)備用。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 mm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫（0～15 min，20%B；15～30 min，20%～75%B；30～50 min，75%～100%B；50～60 min，100%B)；流速：1mL·min-1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；進(jìn)樣量：20 mL。

2.1.4 老香黃色譜指紋圖譜方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)

取1號(hào)老香黃供試液，各連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1%，表明精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)老香黃供試液，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1%，表明穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)老香黃，精密稱量6份，按2.1.2描述的方法制備供試品溶液，記錄色譜圖進(jìn)行分析。結(jié)果測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1%，表明重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.1.5 老香黃橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素含量測(cè)定方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取2.1.2項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液，制備橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素混合溶液，濃度分別為5、10、15、20、25 mg·L-1。按2.1.3的色譜條件，自動(dòng)進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積A為縱坐標(biāo)Y，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)X，得到回歸方程：橙皮苷：Y=17.896X-3.3562，R=0.9992；5,7-二甲氧基香豆素：Y=19.171X-2.607，R=0.9997；表明橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素在5～25 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

（2）精密度試驗(yàn)

取供試對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素峰面積RSD分別為1.28%和0.63%，它們的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為1.21%和0.89%，表明精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)老香黃供試液，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的峰面積，結(jié)果RSD別為1.32%和1.17%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的加樣回收率(n=6)

圖1 對(duì)照品和供試品的HPLC圖

（4）重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取1號(hào)老香黃樣品各6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量，其RSD分別為1.56%和0.36%，它們的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.68%和0.89%，表明此方法的重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn)

取供試27號(hào)老香黃樣品各6份，精密稱定每份1.00 g，加入對(duì)照品溶液。按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試液，測(cè)定橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。

3 結(jié)果

3.1 老香黃HPLC指紋圖譜的測(cè)定與分析

3.1.1 樣品指紋圖譜測(cè)定

對(duì)所有老香黃樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)藥材所有成分能在60 min內(nèi)被洗脫出來(lái)，對(duì)照品和老香黃的色譜圖見(jiàn)圖1。比較27批老香黃樣本的色譜圖，它們的共有成分基本相同，但24～27號(hào)與其他批次的指紋圖譜差異較大。雖然不同產(chǎn)地的樣品都含5,7-二甲氧基香豆素，含量有較大差異（見(jiàn)圖2）。

3.1.2 指紋圖譜的相似度計(jì)算

圖2 老香黃27批樣品的疊加圖譜

本實(shí)驗(yàn)采用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版對(duì)27批老香黃的指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析[11]。首先將各批次樣品的測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件中，選定上述的特征峰進(jìn)行譜峰匹配，通過(guò)中位數(shù)矢量計(jì)算得出其共有圖譜標(biāo)準(zhǔn)模板，結(jié)果如圖2所示；然后進(jìn)行各樣品的相似度評(píng)價(jià)，27批老香黃的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)相似度分析，發(fā)現(xiàn)不同批次老香黃的圖譜的差異變化很大，其中相似度大于0.9的17批，相似度低于0.9的有10批。特別是24號(hào)-27號(hào)的相似度均低于0.9，說(shuō)明這四批老香黃的差異性很顯著。

3.2 老香黃橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量測(cè)定

對(duì)27批老香黃樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在為283 nm下測(cè)定橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量。結(jié)果顯示，27批不同產(chǎn)地的老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量分別介于35.15-145.77 mg·kg-1和35.13-395.15 mg·kg-1，兩者的平均含量分別為73.29 mg·kg-1和139.76 mg·kg-1（表3）。《中國(guó)藥典》規(guī)定佛手橙皮苷≥0.03%[1]，老香黃的橙皮苷含量遠(yuǎn)低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)炮制之后，橙皮苷含量大大降低了。此外，橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素含量的變異系數(shù)分別達(dá)到49.49%和58.70%，說(shuō)明27批老香黃的成分含量差異明顯。

4 討論

（1）中國(guó)藥典中佛手的指標(biāo)成分是橙皮苷，但5,7-二甲氧基香豆素也是佛手的主要成分[12-13]。為了真實(shí)反應(yīng)老香黃的主要活性成分，本文將橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素共同作為老香黃的含量測(cè)定指標(biāo)，并用于老香黃指紋圖譜的指標(biāo)峰加以研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，使用文中所選擇的梯度洗脫程序，能保證樣品的分離度和峰的數(shù)目。同時(shí)，在283 nm波長(zhǎng)下各峰分離度良好，特征性強(qiáng)，峰數(shù)目較多。因此本文優(yōu)化了老香黃的含量測(cè)定條件和指紋圖譜的HPLC條件。

（2）從圖2中可以看出27批老香黃樣品HPLC指紋圖譜雖存在一定差異，但橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素可作為老香黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的特有峰。對(duì)27批老香黃的指紋圖譜進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，色譜圖的整體相貌是相同的，但是不同批次老香黃的指紋圖譜在非共有峰及特征指紋峰的相對(duì)比例大小上還是有較大差別的。這說(shuō)明老香黃的原料、產(chǎn)地和制作工藝差別，使得其指紋圖譜也有較大的差異。本實(shí)驗(yàn)建立了老香黃HPLC指紋圖譜，以及橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量測(cè)定方法，具備良好的專屬性，可作為老香黃的質(zhì)量控制方法。

表2 不同老香黃樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果

表3 27批老香黃橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量

（3）橙皮苷是中國(guó)藥典指定的佛手藥材的指標(biāo)成分，其含量不少于0.03%[1]；但是對(duì)5,7-二甲氧基香豆素卻沒(méi)有要求。林樂(lè)維等發(fā)現(xiàn)佛手中的5,7-二甲氧基香豆素含量很高，平均含量超過(guò)0.2%[13]。從表3中可以看出，雖然橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素是老香黃的特征成分，但在27批老香黃樣品中的含量均不高，遠(yuǎn)低于原材料中的含量。其中的主要原因可能是由于經(jīng)過(guò)多道工藝的炮制，特別是鹽浸和蒸煮等步驟嚴(yán)重流失了橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量。

（4）老香黃貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，身價(jià)就越高。佛手揮發(fā)性成分隨著儲(chǔ)藏時(shí)間逐漸降低。在27批老香黃樣品中，橙皮苷含量平均為73.29 mg·kg-1，香豆素含量平均為139.76 mg·kg-1。結(jié)合樣品的實(shí)際情況，可以看出當(dāng)橙皮苷低于73.29 mg·kg-1，香豆素低于139.76 mg·kg-1時(shí)，老香黃的儲(chǔ)藏時(shí)間較長(zhǎng)，其質(zhì)量也越高。當(dāng)然，橙皮苷和香豆素含量與炮制工藝、儲(chǔ)藏時(shí)間的關(guān)系，還有待于進(jìn)一步研究。

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Analysis on HPLC FingerprintsAnd Index Content Determination of Lao-Xiang-Huang of Chaozhou

Liu Zhicong1,Zhang Zhenxia1,Lai Xuan2,Yang Qicai2,Lu Yuting1,Huang Qiuzhuan1,Zheng Yuzhong1
(1.Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China;2.Guangdong JIGONG Healthy Food Co.,Ltd.,Chao'an 515638,China)

Lao-Xiang-Huang(LXH)ofChaozhouis the processed product of Fructus Citri sarcodactylis.LXH from different producing areas were used as research objects in the study for the establishment of HPLC fingerprints of LXH.Contents of hesperidin and 5,7-dimethoxycoumarin were also determined to provide scientific basis for the establishment of quality standard of LXH.Samples were separated by an Agilent Eclipse XDB C18column(4.6 mm × 250 mm,5 μm)using acetonitrile-0.1%phosphoric acid with water gradient system as a mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The injection volume was 20 μL.The detection wavelength was at 283 nm.The results showed that HPLC fingerprint of LXH was established with good separation and repeatability.The similarity evaluation on 27 batches samples of LXH showed that there was a certain similarity on the HPLC fingerprints of LXH.However,there was a certain difference as a whole.Contents of hesperidin and 5,7-dimethoxycoumarin in LXH were simultaneously determined.It was concluded that the established HPLC fingerprint of LXH and content determination of hesperidin and 5,7-dimethoxycoumarin method were accurate,sensitive and repeatable.It provided scientific evidence for the quality control standard of LXH ofChaozhou.

Lao-Xiang-Huang,Fructus Citri sarcodactylis,HPLC fingerprint,hesperidin,5,7-dimethoxycoumarin

10.11842/wst.2017.08.020

R917

A

2017-05-23

2017-07-20

＊

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030307043)：以佛手為原料的潮汕特色藥食“老香黃”的質(zhì)量控制及健胃消食功效機(jī)制的研究，負(fù)責(zé)人：張振霞；廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(20141305)：以佛手為原料的潮汕“老香黃”的質(zhì)量控制研究，負(fù)責(zé)人：鄭玉忠；廣東順大食品調(diào)料有限公司資助項(xiàng)目(韓合[2012]170號(hào))：潮汕老香黃的質(zhì)量控制和安全性研究，張振霞；潮州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016N02)：復(fù)方佛手膏加工工藝中關(guān)鍵技術(shù)的研究，負(fù)責(zé)人：賴宣；潮州市潮安區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(安財(cái)工[2016]94號(hào))：基于橘皮和佛手的“老藥吉”健康食品的關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：賴宣。

＊＊ 通訊作者：鄭玉忠，博士，副教授，主要研究方向?yàn)橹兴幣谥茖W(xué)、中藥藥理學(xué)。

（責(zé)任編輯：韓覆蔓，責(zé)任譯審：王 晶）