晏磊，郎傳平，王偉東，王彥杰

基于GenBank中16S rRNA分析的產(chǎn)甲烷菌的地域分布特征

晏磊，郎傳平，王偉東，王彥杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

通過(guò)從GenBank中搜集產(chǎn)甲烷菌，探討產(chǎn)甲烷菌的地域分布特征。目前，收集到的甲烷桿菌綱，甲烷球菌綱和甲烷火菌綱產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列235條，相似性分析后剩余191條。綜合分析產(chǎn)甲烷菌16S rRNA的全長(zhǎng)、前段、中段和后段的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可發(fā)現(xiàn)，全球不同地域來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的分布有一定的特征，甲烷球菌綱的產(chǎn)甲烷菌多來(lái)源于海洋沉積物，甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱的來(lái)源比較廣泛，但也有一定的偏好性，沉淀物和動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌具有明顯差別，而同為淡水、油田或是稻田的產(chǎn)甲烷菌的相似性卻較高?；诖送茰y(cè)產(chǎn)甲烷菌的起源可能是多源的，環(huán)境可能作為進(jìn)化壓力在產(chǎn)甲烷菌的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中扮演重要的角色。

產(chǎn)甲烷菌；16S rRNA序列分析；地域分布；系統(tǒng)發(fā)育

甲烷是一種溫室氣體，更是新的清潔能源。產(chǎn)甲烷菌是甲烷的主要來(lái)源，也是一類(lèi)極端厭氧古細(xì)菌，屬水生古細(xì)菌門(mén)（Euryarchaeota）。甲烷細(xì)菌有球形、桿形、螺旋形，八疊球狀等，還有的能連成長(zhǎng)鏈狀[1]。產(chǎn)甲烷菌屬于嚴(yán)格厭氧微生物，常和伴生菌生活在一起，菌體大小形態(tài)都十分相似，在一般光學(xué)顯微鏡下不好判明。而且其生長(zhǎng)繁殖特別緩慢，故而培養(yǎng)分離比較困難。美國(guó)著名微生物學(xué)家Hungate曾在上世紀(jì)50年代培養(yǎng)分離甲烷細(xì)菌并獲得成功[2]。其后世界上很多研究者對(duì)甲烷細(xì)菌進(jìn)行了培養(yǎng)分離工作，并對(duì)Hungate所建立的分離方法進(jìn)行了改良，使甲烷細(xì)菌相比過(guò)去更易于培養(yǎng)分離。產(chǎn)甲烷菌存在于嚴(yán)格厭氧環(huán)境，如人類(lèi)的消化系統(tǒng)和反芻動(dòng)物的瘤胃、動(dòng)物糞便、厭氧污泥和沼氣反應(yīng)器、湖泊或海底沉積物、深部油層和煤層等環(huán)境中均有分布。此外，產(chǎn)甲烷菌還存在于某些極端環(huán)境中[3]，其數(shù)量豐富，種類(lèi)繁多。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第九版）截至2016年產(chǎn)甲烷菌已經(jīng)發(fā)展為4綱5目[5]，分別為甲烷桿菌綱（Methanobacteria），甲烷球菌綱（Methanococci），甲烷微菌綱（Methanomicrobia），甲烷火菌綱（Methanopyri），尤其是甲烷微菌綱包括產(chǎn)甲烷菌數(shù)目最多。通過(guò)對(duì)其基因組學(xué)的研究使得對(duì)其代謝特點(diǎn)和分類(lèi)與其地域分布的聯(lián)系被了解。

16S rRNA經(jīng)常被用來(lái)作為原核生物系統(tǒng)發(fā)育以及多樣性研究的標(biāo)志性基因，用表型方法鑒定有困難的原核生物，用16S rRNA序列分析能進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定[4]。目前為止，中國(guó)，日本，印度，德國(guó)，中國(guó)臺(tái)灣，美國(guó)，俄羅斯，太平洋，印度洋以及大西洋等世界各處均有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌。因而，通過(guò)對(duì)GenBank中搜索到的235條產(chǎn)甲烷菌序列的16S rRNA的分析，了解產(chǎn)甲烷菌的地域分布特征，進(jìn)而探尋到產(chǎn)甲烷菌進(jìn)化起源。

1 數(shù)據(jù)來(lái)源與分析方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

截止到2016年4月15日在GenBank中搜索得到的235條產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列。搜索的關(guān)鍵詞有 methanogen 16s，archaeon clone biogas 16s，archaeon methane-producing 16s等，盡可能包括所有產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA。由于存在許多長(zhǎng)短不一的序列，因而在搜索數(shù)據(jù)時(shí)對(duì)其長(zhǎng)度要求為>700 bp，并且對(duì)其進(jìn)行甄別，去除非產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA序列。

1.2 數(shù)據(jù)整理與分析方法

將得到的所有產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列信息進(jìn)行整理，利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 在線比對(duì)工具對(duì)比，根據(jù)Stackebrant等認(rèn)為16S rRNA相似性>97%，認(rèn)為屬于同一個(gè)種[6]，對(duì)于同一地點(diǎn)，同一批次提交的16S rRNA序列，若有兩條序列相似性>97%，則認(rèn)為兩者屬于同一種產(chǎn)甲烷菌，只需保留一條即可[7]。對(duì)所有序列進(jìn)行整理，確定其分離源，國(guó)家，分類(lèi)地位等，并且統(tǒng)計(jì)不同生境產(chǎn)甲烷菌在各綱中所占比例。在構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)，由于所取得的序列長(zhǎng)短不一，所作出的進(jìn)化樹(shù)可靠性不強(qiáng)，所以利用產(chǎn)甲烷菌的 16S rRNA 的前段（800 bp），中段（500 bp），后段（1 000 bp）和全長(zhǎng)分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（利用MEGA4.0軟件采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)）。同時(shí)就不同生境，不同分離源，不同特點(diǎn)的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行分析，以尋求地域規(guī)律性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)整理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后獲得剩余產(chǎn)甲烷菌16S rRNA191條，對(duì)其分離源進(jìn)行分類(lèi)整理，分別為沉積物來(lái)源（包括來(lái)自海洋，陸地，油田，地下水，紅樹(shù)林等各種生境的沉積物），生物反應(yīng)器來(lái)源（包括UASB反應(yīng)器，沼氣反應(yīng)器，沼氣發(fā)電場(chǎng)等各種生物反應(yīng)器），動(dòng)物來(lái)源（包括反芻動(dòng)物的瘤胃，動(dòng)物糞便，食木昆蟲(chóng)的消化道等）。這三種分離源的產(chǎn)甲烷菌16S rRNA數(shù)量分別為110，39，42，在各綱中的比例見(jiàn)圖1。產(chǎn)甲烷菌最多的是甲烷微菌綱，其次是甲烷桿菌綱，甲烷火菌綱收集的數(shù)據(jù)較少，結(jié)合分離源分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌的甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱在三種來(lái)源中均占有很大比例，說(shuō)明在自然界這倆綱的產(chǎn)甲烷菌的分布非常廣泛，數(shù)量領(lǐng)先，因此，甲烷微菌綱是目前產(chǎn)甲烷菌中研究最多的種類(lèi)。而甲烷菌的動(dòng)物來(lái)源中甲烷桿菌綱的數(shù)目高于甲烷微菌綱，這也許和動(dòng)物體內(nèi)特殊的微環(huán)境有關(guān)。

在收集到的191條產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA中，有甲烷桿菌綱57條，甲烷球菌綱14條，甲烷微菌綱119條，甲烷火菌綱1條，上述四綱的分離來(lái)源以及具體分布情況如表1。GenBank中現(xiàn)有的產(chǎn)甲烷菌主要分布于中國(guó)，德國(guó)，日本，印度，美國(guó)，中國(guó)臺(tái)灣，太平洋，印度洋，大西洋等地。各個(gè)地區(qū)中大多以甲烷微菌綱的甲烷菌數(shù)目最多，而美國(guó)和法國(guó)卻以甲烷桿菌綱的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，另外甲烷微菌綱的分布集中于各大海洋。

2.2 產(chǎn)甲烷菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖2，由產(chǎn)甲烷菌的前段，中段，后段以及全段所作出的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)雖然細(xì)節(jié)不同，但大體形狀是相似的，分別出現(xiàn)四個(gè)分枝，為分類(lèi)學(xué)上的四綱，從進(jìn)化樹(shù)中可以看出從總的分類(lèi)上來(lái)看，分離源相同的大多聚類(lèi)分區(qū)明顯，但也有少數(shù)是例外的。以TR-Z13，NBRC 103675為代表的微菌綱的產(chǎn)甲烷菌形成一個(gè)最大的分支，以A3，F(xiàn)S406-22為代表的甲烷球菌形成一個(gè)較小的分支，以8-2，ATM為代表的甲烷桿菌形成另一個(gè)分支，這些都與實(shí)際觀察相符合。

2.3 不同分離源的產(chǎn)甲烷菌的比較

2.3.1 沉積物來(lái)源與動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷細(xì)菌的比較

沉積物與動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷細(xì)菌比較（見(jiàn)圖1），由圖可知沉積物來(lái)源中甲烷微菌綱（66.4%）占優(yōu)勢(shì)，而在動(dòng)物來(lái)源中以甲烷桿菌綱（61.9%）為主，另外還發(fā)現(xiàn)球菌綱大多數(shù)只來(lái)源于沉淀物。圖3是動(dòng)物來(lái)源和沉淀物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA的單獨(dú)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)此觀察分析得到，沉淀物來(lái)源與動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的相似性較低，系統(tǒng)進(jìn)化位置差別明顯。動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA，相似性較高（90%以上），而沉淀物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA的相似性較低（最高為97%，最低為72%）。

圖1 產(chǎn)甲烷菌16S rRNA各綱的來(lái)源比例Fig.1 The classification proportion of source with 16S rRNA for Methanogenic bacteria

表1 產(chǎn)甲烷菌數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（據(jù)提交GenBank的16S rRNA序列數(shù)統(tǒng)計(jì)）Table 1 Methanogenic Bacteria statistics（according to the 16S rRNA submitted to the GenBank）

2.3.2 不同的沉淀物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的比較

圖2 產(chǎn)甲烷菌16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of Methanogenic bacteria注：圖2中加菱形符號(hào)的16S rRNA序列為動(dòng)物來(lái)源

由圖3可知，來(lái)自淡水沉積物和海水沉淀物的產(chǎn)甲烷菌各自聚類(lèi)分區(qū)較為明顯，來(lái)自淡水的產(chǎn)甲烷菌屬于甲烷微菌綱居多，且球菌綱數(shù)目稀少，目前未發(fā)現(xiàn)來(lái)源于淡水沉淀物甲烷微菌綱的產(chǎn)甲烷菌；來(lái)自海水沉淀物的甲烷菌在各綱都有分布，種類(lèi)豐富，相似性相差較大（最高達(dá)99%，最低只有79%），來(lái)自淡水和海水的甲烷微菌綱的相似性較高。對(duì)于沉淀物中其他來(lái)源，如全球各地的水稻田中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA進(jìn)行兩兩比對(duì)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌兩兩相似性較高（平均85%以上），另外又對(duì)沉淀物中全球油田來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA進(jìn)行了兩兩相似性分析，發(fā)現(xiàn)兩兩相似性也較高（平均88%以上）。

2.3.3 不同的動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的比較

由圖4可知，反芻動(dòng)物瘤胃和動(dòng)物糞便來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的聚類(lèi)分區(qū)不明顯，進(jìn)化樹(shù)分叉為甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱兩種來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌在上述兩綱中的分布較為均勻，對(duì)產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA進(jìn)行兩兩比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩種來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌在同一綱中的兩兩相似性較高（平均85%以上）。

圖3 海洋沉淀物與淡水沉淀物的來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16SrDNA of Methanogenic bacteria in marine sediments and freshwater sediments注：圖3中圓形圖標(biāo)的是淡水沉淀物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌16S rRNA序列

圖4 動(dòng)物糞便和反芻動(dòng)物瘤胃來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16SrDNA of Methanogenic bacteria in animal manure and rumen in ruminants注：圖4帶有方形標(biāo)記的是動(dòng)物糞便來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA序列

3 討論

對(duì)于不同區(qū)域來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相似性高的產(chǎn)甲烷菌多來(lái)源于相近的環(huán)境中。如已獲得純培養(yǎng)的2株產(chǎn)甲烷菌MT（AY260432.1）和 SMA-21（NR 109423.1），兩者的相似性大于97%[7-8]，他們分別發(fā)現(xiàn)于德國(guó)寒冷的陸地和西伯利亞勒拿河三角洲的活性凍土。兩株可培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷菌的 DMS1（AF120163.1）和 TM（AJ276437.1）的相似性也高于97%[9-10]，分別發(fā)現(xiàn)于荷蘭和坦桑尼亞的淡水湖中。法國(guó)腦膿腫病人的膿液中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌Vande（LN876656.1）與美國(guó)動(dòng)物的糞便中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌GS（NR 044788.1）的相似性達(dá)97%[11-12]。此外，甲烷球菌綱的產(chǎn)甲烷菌多發(fā)現(xiàn)于海洋，由此表明產(chǎn)甲烷菌的分布可能具有一定的區(qū)域性特征。產(chǎn)甲烷菌可能作為土著菌生活在海洋中，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，形成了特定的形態(tài)。如上文所分析，相似的產(chǎn)甲烷菌多來(lái)源于相近的環(huán)境中，這也可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期演化過(guò)程中環(huán)境條件作為重要的進(jìn)化壓力使得處于相似環(huán)境中的產(chǎn)甲烷菌向相同方向進(jìn)化。然而也有不同的情況，如三株產(chǎn)甲烷菌如H-A4（KF952484.1）、PL-15/HP（DQ136171.1）和 Mic6c09（AB546256.1）分別分離于墨西哥高鈉鹽堿土的特斯科湖、美國(guó)阿拉斯加的海洋沉積物和日本腐蝕的天然氣管道中[13－16]。究其原因可能是三株菌在單獨(dú)進(jìn)化過(guò)程中的趨同進(jìn)化，可能是進(jìn)化偶然，也有可能是環(huán)境中某個(gè)環(huán)境因子（如pH）作為進(jìn)化壓力促使產(chǎn)甲烷菌朝同一方向進(jìn)化。研究受目前GenBank的產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA的數(shù)目限制，隨著對(duì)產(chǎn)甲烷菌的更加深入的研究，將得到更多純培養(yǎng)的菌株，更多更大數(shù)量的產(chǎn)甲烷菌的發(fā)現(xiàn)，必然能使人們獲得更加全面的關(guān)于不同地域分布的產(chǎn)甲烷菌的特征，并為產(chǎn)甲烷菌的生態(tài)意義和應(yīng)用前景做出更多貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

不同區(qū)域產(chǎn)甲烷菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌具有明顯的生態(tài)分布特征。沉淀物來(lái)源和動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌區(qū)分明顯，淡水和海水來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌也有明顯差別。而同為沉淀物和動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)甲烷菌的相似性較高，反映生態(tài)環(huán)境和產(chǎn)甲烷菌的分布相關(guān)性密切。這些觀測(cè)都暗示在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，環(huán)境條件作為重要的進(jìn)化壓力，促使產(chǎn)甲烷菌向同一方向進(jìn)化（相似的環(huán)境形成相似的產(chǎn)甲烷菌類(lèi)型）或多方向進(jìn)化（不同環(huán)境形成了不同的產(chǎn)甲烷菌類(lèi)型），由此說(shuō)明產(chǎn)甲烷菌的起源可能是多源的。

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Geographical Distribution Characteristics of Methanogenic Bacteria Based on the Analytics of 16S rRNA in GenBank

Yan Lei，Lang Chuanping，Wang Weidong，Wang Yanjie
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The geographical distribution characteristics of methanogen were discussed through collecting the methanogen from Gen－Bank，235 sequences of 16S rRNA of methanogenic bacteria were collected，191 sequences were left after the filtering.It could be found that the global distribution of methanogens from different regions had certain characteristics after the full-length，front，middle and rear sections of the phylogenetic tree of the 16S rRNA of the methanogens being analyzed comprehensively.The large majority of the Methanococcus are from the ocean sediments.Although，huge numbers of Methanobacteria and Methanomcrobia were widespread throughout the entire earth but had a certain preference，Methanogens isolated from sediments and animals respectively had significant differences，those strains with similar habitats had higher similarity such as the trains from fresh water，oil and paddy.The type of Methanogen was closely related to the habitat condition.Thus，the origin of methanogenic bacteria might be multiple and the environment play an important role in its long evolutionary process.

methanogen;16S rRNA of sequence analysis;geographical distribution;Phylogeny

Q938

A

1002-2090（2017）05-0059-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.015

2016-10-21

秸稈發(fā)酵高效產(chǎn)沼氣菌系的構(gòu)建及功能（B2011-13）。

晏磊（1981-），男，副教授，蘭州大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事微生物方面的教學(xué)與研究工作。