馬寅芙，李首慶，米旭光，魏海峰，譚 巖，方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院 醫(yī)學診治實驗中心， 吉林 長春130021)

miR-126和miR-199對乳腺癌細胞周期進程的影響

馬寅芙，李首慶，米旭光，魏海峰，譚 巖，方艷秋*

(吉林省人民醫(yī)院 醫(yī)學診治實驗中心， 吉林 長春130021)

目的探討miR-126和miR-199在乳腺癌細胞中的表達對腫瘤細胞周期的影響。方法以qRT-PCR檢測分析在乳腺癌細胞中miR-126和miR-199的表達情況；以miRNA mimics轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞株MDA-MB-231，檢測miR-126和miR-199在表達增高的情況下對乳腺癌細胞周期的影響。結(jié)果miR-126和miR-199在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達較MCF-7細胞株明顯更低；轉(zhuǎn)染miRNA mimics 48h后，乳腺癌細胞株MDA-MB-231中的miR-126和miR-199的表達顯著上調(diào)，可促進細胞凋亡，阻滯乳腺癌細胞周期進程。結(jié)論提高miR-126和miR-199在乳腺癌細胞中的表達可抑制腫瘤細胞周期進程，發(fā)揮抗腫瘤效果。

miR-126；miR-199；乳腺癌；細胞周期

(ChinJLabDiagn,2017,21:1828)

MicroRNA(miRNA)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，起著癌基因或抑癌基因的作用[1,2]。每種腫瘤都有自己的miRNA表達譜，通過對miRNA在腫瘤中的表達譜分析發(fā)現(xiàn)，miRNA對腫瘤具有診斷分析意義，miRNA有可能成為一種腫瘤臨床應(yīng)用的新生物標記物。miRNA在腫瘤中的表達程度不同，對腫瘤產(chǎn)生的作用也有差異。本研究旨在研究miR-126和miR-199在乳腺癌細胞中表達升高時對乳腺癌細胞周期產(chǎn)生的影響和作用。

1 材料和方法

1.1細胞株與試劑人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7為本實驗室凍存；胎牛血清、LipofectamineTM2000、 Trizol購自美國Life Technologies公司；DMEM培養(yǎng)、RPMI medium 1640基購自美國GIBCO公司； Has-miR-126 mimics、Has-miR-199 mimics及陰性對照Cel-miR-67 mimics購自上海百奧邁科生物技術(shù)有限公司；miR-126、miR-199、U6引物購自上海生工公司；SYBR Green Master購自瑞士Roche公司；RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司；碘化丙啶染液購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；其他常用試劑均購自北京化工廠。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231用含雙抗(100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素)、10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；MCF-7細胞株用含雙抗的RPMI medium 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。細胞置于37℃，5% CO2，100%飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)染的細胞，在轉(zhuǎn)染前一天細胞密度達到80%左右時，用胰酶消化將細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，以密度為2×105個/孔接種細胞。轉(zhuǎn)染當天細胞密度可達70%左右。每孔轉(zhuǎn)染miRNA mimics 5 μl(終濃度為50 nM)，操作步驟參考脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞分兩部分，一部分用于提取RNA，另一部分細胞用于進行流式檢測。

1.2.2總RNA提取和qRT-PCR檢測 用Trizol法提取乳腺癌細胞株總RNA。用紫外分光光度計測量RNA的純度和濃度。參考逆轉(zhuǎn)錄說明書將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將獲得的cDNA 以5倍稀釋用于熒光定量PCR檢測。使用2×SYBR Green Master應(yīng)用ABI7500 Real-Time PCR儀測定。miRNA的表達以U6作為內(nèi)參，結(jié)果以2-△△Ct表示mRNA拷貝數(shù)比值。hsa-miR-126:頸環(huán)引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′，miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′，hsa-miR-199:頸環(huán)引物5′-GTCGT ATCCA GTGCA GGGTC CGAGG TATTC GCACT GGATA CGACT AACCA-3′，miR-199a-3p forward primer:5′-GTCAC AGTAG TCTGC ACAT-3′，miRNA Universal primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞周期 收集細胞：用胰酶消化細胞后離心(1 000 g/min離心5分鐘)收集細胞，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，棄上清。固定細胞： 將1 ml預(yù)冷的70%乙醇加入細胞沉淀中，吹懸混勻，4℃固定2 h。染色：離心收集固定的細胞，加1 ml預(yù)冷的PBS洗滌細胞，1 000 g/min離心5分鐘，棄上清；細胞中加入500 μl碘化丙啶(PI)，緩慢并充分混勻細胞，4℃避光孵育30 min，混勻上機。應(yīng)用流式細胞儀(COULTER Epics XL)檢測，應(yīng)用Wincycle 32軟件進行細胞周期分析。

2 結(jié)果

2.1miR-126和miR-199在乳腺癌細胞中的表達水平

實驗重復(fù)三次(n=3)，每次設(shè)3個復(fù)孔。應(yīng)用熒光定量 PCR儀檢測miR-126及miR-199在乳腺癌細胞中的表達。結(jié)果如圖1所示，相對于乳腺癌細胞株MCF-7，miR-126和miR-199在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達明顯更低。

注：**.P<0.01

2.2轉(zhuǎn)染miRNAmimics對乳腺癌細胞株MDA-MB-231中miR-126和miR-199的表達影響

以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-126和miR-199 mimics入MDA-MB-231細胞中，終濃度為50 nM，以U6為內(nèi)參，Cel-mir-67 mimics為陰性對照(negative control,NC)。用2-ΔΔCt法分析real-time PCR實驗數(shù)據(jù)。重復(fù)三次實驗(n=3)，每次實驗3個復(fù)孔。實驗結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染miRNA mimics 48 h后，可使低表達miR-126和miR-199的乳腺癌細胞株MDA-MB-231中此2種miRNAs的表達顯著上調(diào)(**P<0.01)。

注：**.P<0.01

圖2乳腺癌細胞株MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染miRNAmimics后miR-126(A)和miR-199(B)表達分析

2.3上調(diào)MDA-MB-231細胞中miR-126和miR-199的表達對細胞周期的影響

如圖3所示，以流式細胞術(shù)檢測MDA-MB-231細胞分別轉(zhuǎn)染miR-126和miR-199 mimics后(終濃度為50 nM)，可誘導(dǎo)細胞凋亡(*P<0.05，**P<0.01)。相對于NC對照組，miRNA mimics轉(zhuǎn)染組明顯細胞周期受到抑制，G1期阻滯延長(*P<0.05)。結(jié)果顯示提高MDA-MB-231細胞中miR-126及miR-199的表達水平，可明顯抑制乳腺癌細胞的細胞周期進展，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

注：*.P<0.05，**.P<0.01

(A)ApoptoticcellsanalyzedaftertransfectionwithmiR-126andmiR-199mimicsofMDA-MB-231cells;CellcycledistributionanalyzedofmiR-126(B)andmiR-199(C)aftermimicstransfectedinMDA-MB-231cells.

3 討論

人類發(fā)現(xiàn)miRNA所起的作用類似于癌基因或抑癌基因的功能[1,2]。miRNA在腫瘤組織中提高表達，它起到癌基因的作用；而miRNA在腫瘤組織中降低表達，它起到抑癌基因的作用。miRNA的表達調(diào)控癌基因或抑癌基因影響細胞的增殖和凋亡。在多項研究中證實，miR-126可在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中表達下調(diào)[3-5]，miR-199在卵巢癌、肝細胞癌、腎細胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、骨肉瘤等腫瘤中表達降低[6]，miR-126和miR-199在乳腺癌中表達均降低[7,8]，而提高miR-126和miR-199的表達可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，降低腫瘤復(fù)發(fā)率和提高患者生存率[6,11]。

miR-126和miR-199發(fā)揮抑癌基因的作用，可能與其抑制靶基因的表達相關(guān)[6,9-11]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中上調(diào)miR-126可以降低VEGF的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力；上調(diào)miR-199表達可以抑制PAK4的表達，從而抑制PAK4/MEK/ERK途徑，乳腺癌細胞的生長，遷移和侵襲能力都受到抑制。

本研究中顯示，乳腺癌組織中miR-126和miR-199在不同侵襲力的乳腺癌細胞株中的表達顯示出差異，即侵襲力強的乳腺癌細胞株MDA-MB-231相對于侵襲力較弱的MCF-7細胞株 miR-126和miR-199表達明顯降低。所以，我們選擇表達量相對較低的乳腺癌細胞株MDA-MB-231轉(zhuǎn)染miRNA mimics進行研究。在研究miR-126和miR-199抑制乳腺癌的機制中，我們對其在乳腺癌中表達升高引起的腫瘤細胞凋亡和細胞周期情況進行分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)這兩種miRNA的表達，可誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，抑制細胞周期進程，使G1期阻滯延長。由此證明miR-126和miR-199促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞周期進程，是其發(fā)揮腫瘤抑制作用的重要機制之一。

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EffectsofmiR-126andmiR-199oncellcycleofbreastcancer

MAYin-fu,LIShou-qing,MIXu-guang,etal.

(MedicalExperimentCenter,JilinProvincePeople’sHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveInvestigate the effect of miR-126 and miR-199 on the cell cycle in breast cancer cells.MethodsThe expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cells was detected by qRT-PCR assay;the effect of miR-126 and miR-199 expression on the cell cycle of breast cancer cells was detected after miRNA mimics were transfected into breast cancer cell line MDA-MB-231.ResultsThe expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cell line MDA-MB-231 was significantly lower than that of MCF-7 cell line;after transfection of miRNA mimics 48h,the expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cell line MDA-MB-231 was up-regulated,which could promote cell apoptosis and block the cell cycle progression of breast cancer.ConclusionIncreasing the expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cells can inhibit tumor cell cycle progression and exert anti-tumor effect.

miR-126;miR-199;breast cancer;cell cycle

R737.9

A

2016-10-11)

吉林省科技廳青年科研基金項目(20160520165JH)；吉林省科技廳重點實驗室專項建設(shè)基金(20160622008JC)；吉林省科技廳自然科學基金項目(20150101178JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1828-03