杜紅彥 李建良 駱 煌 閆 冉 蔡金英 王 蓉（廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州510120）

川芎嗪注射液對(duì)高眼壓大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響*

杜紅彥 李建良 駱 煌 閆 冉 蔡金英 王 蓉△（廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州510120）

目的觀察川芎嗪注射液對(duì)高眼壓大鼠模型視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響并探討其機(jī)制。方法應(yīng)用前房注射羥丙基甲基纖維素的方法建立高眼壓大鼠模型，隨機(jī)分為模型組、川芎嗪組，并設(shè)立空白對(duì)照組，每組10只。造模成功3 d后開始給藥，川芎嗪組給予鹽酸川芎嗪注射液7.2mg/kg腹腔注射。模型組和空白對(duì)照組每天用等體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。每日1次，共2周。觀察川芎嗪注射液對(duì)高眼壓模型大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果川芎嗪組視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白的表達(dá)增高，與模型組和空白對(duì)照組比較其間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；川芎嗪組視網(wǎng)膜Bax蛋白的表達(dá)低于模型組，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。川芎嗪組的Bcl-2/Bax比值最高，與模型組和空白對(duì)照組比較其間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。川芎嗪組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)低于模型組，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論川芎嗪注射液能夠減少高眼壓大鼠模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是通過升高視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白的表達(dá)、降低Bax蛋白的表達(dá)、改變Bcl-2/Bax的比值而實(shí)現(xiàn)的。

川芎嗪注射液 青光眼 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡Bcl-2 Bax

青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）及其軸突數(shù)目進(jìn)行性丟失、視野逐漸喪失和視神經(jīng)萎縮為特征的眼部疾病[1]。青光眼可導(dǎo)致患者的視力逐漸喪失，直至失明，在全世界的致盲性眼病種位列第2。流行病學(xué)資料顯示[2－3]，目前我國(guó)青光眼患病人數(shù)達(dá)700萬，其中有65萬左右的患者致盲，預(yù)計(jì)到2020年世界的青光眼患病人數(shù)將會(huì)突破8000萬，青光眼的高發(fā)病率及其致盲的嚴(yán)重后果將會(huì)對(duì)患者及其家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力。RGCs及其軸突的變性、萎縮和喪失是導(dǎo)致青光眼視功能永久損傷的主要病理機(jī)制，而細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致RGCs喪失的重要因素[4－6]。 本研究通過觀察川芎嗪注射液對(duì)高眼壓大鼠模型視網(wǎng)膜Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)及RGCs凋亡的影響，探討川芎嗪保護(hù)青光眼視神經(jīng)損傷的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用10周齡的SD大鼠，雌雄各半共30只，體質(zhì)量（250±50）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的許可證編號(hào)：SYXK（粵）2013－0085。實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行裂隙燈、眼底鏡檢查及眼壓測(cè)量，眼前節(jié)、眼底正常，眼壓＜21 mmHg的動(dòng)物方可選用。

1.2 藥物與儀器 鹽酸川芎嗪注射液，由上海現(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20054485。眼用羥丙基甲基纖維素，由天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司提供，國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3220731號(hào)。

1.3 分組與造模 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、川芎嗪組。10%水合氯醛（4mL/kg）腹腔注射麻醉，右眼表麻下抽出前房房水0.1 mL后，注入等量的羥丙基甲基纖維素，使其干預(yù)期內(nèi)眼壓均維持在30～39mmHg?？瞻讓?duì)照組注入等量0.9%氯化鈉注射液，均在30min后測(cè)量眼壓。

1.4 給藥方法 造模3 d后開始給藥，藥物劑量換算參考徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，采用體表面積換算法。川芎嗪組：給予鹽酸川芎嗪注射液7.2mg/kg腹腔注射。模型組和空白對(duì)照組用等體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。每日1次，共2周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5 .1眼壓檢測(cè) 以0.5%的鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，Schiotz眼壓計(jì)連續(xù)測(cè)量眼壓3次，取平均值。

1.5 .2免疫組化法檢測(cè)Bcl－2、Bax的表達(dá) 視網(wǎng)膜標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、復(fù)染、脫水、透明、封片等處理。免疫組化借助HPIAS－2000高清晰彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)，每張組織切片隨機(jī)取10個(gè)視野，測(cè)定視網(wǎng)膜組織Bcl－2、Bax，根據(jù)其光密度計(jì)算各組的平均吸光度值（MOD）。

1.5 .3細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL法）[7]將視網(wǎng)膜切成0.5mm3的小塊，用4%多聚甲醛磷酸固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，光鏡下觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。正常的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核染色呈藍(lán)色，而凋亡的細(xì)胞核呈棕褐色，觀察細(xì)胞核數(shù)大于400個(gè)，根據(jù)（陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)）計(jì)算出視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用單因素方差分析。方差齊時(shí)采用LSD法；方差不齊時(shí)采用Tamhane’T2法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后眼壓水平比較 見表1。造模前1 d，各組之間的眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后30min和用藥后2周，模型組和川芎嗪組眼壓均有明顯升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組與川芎嗪組比較其間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后眼壓水平比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后眼壓水平比較（mmHg，±s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別n用藥后2周造模前1 d造模后30min空白對(duì)照組10 20.39±0.72模型組10 33.79±0.96**18.59±0.64 21.49±2.09 18.49±0.69 34.59±2.05**川芎嗪組10 34.69±1.02**18.49±0.65 34.59±1.68**

2.2 川芎嗪對(duì)模型大鼠視網(wǎng)膜Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)的影響 見表2。結(jié)果示各組大鼠間Bcl－2比較，空白對(duì)照組最低，其與模型組和川芎嗪組比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 模型組和川芎嗪組的Bcl－2與空白對(duì)照組比較均有明顯升高，川芎嗪組升高幅度大于模型組（P＜0.01）。 各組大鼠間Bax比較，空白對(duì)照組最低，其與模型組和川芎嗪組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組和川芎嗪組的Bax與空白對(duì)照組比較均有明顯升高，模型組升高幅度大于川芎嗪組，（P＜0.01）。 各組間Bcl－2/Bax比較，模型組最低，川芎嗪組最高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)水平比較（吸光度值，s）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)水平比較（吸光度值，s）

組 別n Bcl－2/Bax Bcl－2 Bax空白對(duì)照組10 1.26±0.19模型組10 0.58±0.58**20.28±2.28 16.19±1.57 31.83±2.82**54.88±4.54**川芎嗪組10 1.58±0.16**△△47.38±5.90**△△30.10±2.91**△△

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 見表3，圖1。表3示各組大鼠間視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較，空白對(duì)照組最低，其與模型組和川芎嗪組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組的凋亡指數(shù)最高，其與川芎嗪組比較組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。光鏡結(jié)果示空白對(duì)照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞偶見凋亡，模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比空白對(duì)照組明顯增多，凋亡細(xì)胞核染色呈深棕色，顏色明顯加深。川芎嗪組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組減少，但多于空白對(duì)照組，凋亡細(xì)胞核染色呈淺棕色。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

組 別n 凋亡指數(shù)（%）空白對(duì)照組10模型組10 6.50±1.78 53.25±5.90**川芎嗪組1031.46±2.62**△△

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜石蠟切片光學(xué)顯微鏡像（TUNEL法標(biāo)記，400倍）

3 討 論

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡是青光眼導(dǎo)致視力損傷的主要病理因素[9-11]，RGCs是構(gòu)成視網(wǎng)膜神經(jīng)元的主要細(xì)胞，而且RGCs一旦發(fā)生變性壞死便很難再生，最終導(dǎo)致視功能的不可逆損傷[12]，因此有效防止RGCs的凋亡是保護(hù)青光眼視神經(jīng)損傷的重要途徑。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡受到多種基因調(diào)控[13]，目前研究發(fā)現(xiàn)與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因有：Bcl-2、Bax、Bcl-x、以及P53等，其中Bcl-2、Bax對(duì)RGCs凋亡的調(diào)控起主要作用。Bcl-2是一種原癌基因，通過其編碼的Bcl-2蛋白能夠起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，是重要的抗凋亡基因[14-15]。Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制有[16-18]：降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平，減少細(xì)胞色素C的釋放以及阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞活化等。Bax基因則能夠促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是重要的促凋亡基因[19]。眼壓正常時(shí)，視網(wǎng)膜中的Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)基本穩(wěn)定。眼壓增高時(shí)，Bax蛋白在視網(wǎng)膜中過表達(dá)，Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量顯著增多，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在Bcl-2表達(dá)增加時(shí)，則可引起B(yǎng)ax/Bax二聚體解離，而形成穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異源二聚體，從而有效拮抗Bax誘導(dǎo)的RGCs凋亡[16]。 因此，調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平，是減少RGCs凋亡，防治青光眼視神經(jīng)損傷的重要途徑。

青光眼屬中醫(yī)學(xué)“綠風(fēng)內(nèi)障”“青風(fēng)內(nèi)障”范疇，對(duì)于本病的病因病機(jī)，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)有比較深刻的認(rèn)識(shí)。本課題組認(rèn)為青光眼的主要病機(jī)為氣血失和，脈絡(luò)不利，玄府閉塞，神水瘀積而成此病。青光眼視神經(jīng)損害機(jī)理不外乎“瘀”與“虛”兩端，初起以瘀為主，后期以虛為主，虛實(shí)夾雜，因此治療本病以活血祛瘀、行氣開郁、祛風(fēng)止痛為法。本課題組臨床研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪注射液有減輕青光眼患者臨床癥狀，改善視野，提高視力的作用?，F(xiàn)代研究表明[20-21]，川芎嗪具有抗脂質(zhì)過氧化、抗自由基、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、鈣拮抗等作用，具有視神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，川芎嗪注射液能夠降低高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的，與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光鏡結(jié)果顯示，模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)比空白對(duì)照組明顯增多，凋亡細(xì)胞核染色呈深棕色，顏色明顯加深。川芎嗪組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組減少，但多于空白對(duì)照組，凋亡細(xì)胞核染色呈淺棕色。免疫組化結(jié)果顯示，川芎嗪組大鼠的Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增高，與模型組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Bax蛋白的表達(dá)較模型組低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。川芎嗪組的Bcl-2/Bax比值最高，與模型組和空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上研究結(jié)果表明，川芎嗪注射液能夠減少高眼壓大鼠模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，具有視神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過升高視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低Bax蛋白的表達(dá)，從而改變Bcl-2/Bax的比值而實(shí)現(xiàn)的。

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Effects of Ligustrazine Injection on Expression of Bcl-2 and Bax Proteins in Retina and Apoptosis of Retinal Ganglion Cells of Rats with High Intraocular Pressure

DU Hongyan，LI Jianliang，LUO Huang，et al.Guangzhou Hospital of TCM，Guangdong，Guangzhou 510120，China.

Objective：To observe the effect of Ligustrazine Injection on the expression of Bcl-2 and Bax protein in the retina and the apoptosis of retinal ganglion cells of rats with high intraocular pressure.Methods：Ratmodels of intraocular hypertension were established by injecting the hydroxypropyl methylcellulose into the anterior chamber and randomly divided into the model group，Ligustrazine group and the blank control group，10 cases in each.Three days after the success of modeling，the drug was administered to the Ligustrazine group，which was intraperitoneally injected with 7.2 mg/kg.The model group and the blank control group were injected intraperitoneally with equal volume of saline per day，once a day for 2 weeks.The effect of Ligustrazine Injection on the expression of Bcl-2 and Bax protein and the apoptosis of retinal ganglion cells in ratswith high intraocular pressure was observed.ResultsThe expression of Bcl-2 protein in Ligustrazine group was significantly higher than that in the model group and the blank control group（P＜0.01）.The expression of Bax protein in Ligustrazine group was lower than that in the model group；the difference between the two groups was statistically significant（P＜0.01）.The ratio of Bcl-2/Bax in Ligustrazine group was the highest，which was significantly different from that in the model group and the blank control group（P＜0.01）.The apoptotic index of retinal ganglion cells in Ligustrazine group was lower than that in the model group；the difference between the two groups was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionLigustrazine Injection can reduce the apoptosis of retinal ganglion cells in rats with high intraocular pressure.The mechanism may be achieved by increasing the expression of the retina Bcl-2 protein，reducing the expression of Bax protein，and changing the ratio of Bcl-2/Bax.

Ligustrazine Injection；Glaucoma；Retinal ganglion cell apoptosis；Bcl-2；Bax

R285.5

A

1004-745X（2017）10-1703-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.004

廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（20141211）；廣東省廣州市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目（20142A010003）△通信作者（電子郵箱：gzwsr@126.com）

2017-05-03）