中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081

藥物分析中的生物樣品前處理概況

張亞琛黃火強(qiáng)*杜麗潔

中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081

生物樣品包括血漿、組織、尿液及細(xì)胞等，具有成分復(fù)雜、干擾物質(zhì)多等特點，對生物樣品前處理技術(shù)極大的影響了實驗的靈敏度與準(zhǔn)確性。文章主要對生物樣品處理常用技術(shù)的特點、方法以及在藥物研究方面的應(yīng)用等進(jìn)行了綜述，并對未來技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行展望。

生物樣品；蛋白質(zhì)沉淀；液-液萃??；固相萃取

生物樣品的前處理是生物分析的一個重要環(huán)節(jié)。正常情況下，藥物、代謝物以及生物標(biāo)志物存在于復(fù)雜的生物基質(zhì)中，主要包括鹽、酸、堿、蛋白質(zhì)和許多外源性或內(nèi)源性小分子，比如脂類和脂蛋白。而生物樣品的前處理就是采取適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，最大程度消除基質(zhì)對分析物的影響，為藥物及其代謝產(chǎn)物的測定創(chuàng)造條件。有效的預(yù)處理是確保得到準(zhǔn)確的生物分析結(jié)果的基礎(chǔ)，且占用了80%的生物分析時間[1]，因此樣品的制備被視為決定分析的步驟[2]。

生物樣品主要包括血漿、血清、全血、尿液、唾液以及組織，其中最常用的是血漿或血清，可較好地體現(xiàn)藥物濃度和治療效果之間的關(guān)系。當(dāng)藥物或其快速型代謝物大量排泄到尿中時，也采用尿液樣品檢測血樣中不易檢出的藥物。筆者主要對常用的生物樣品的預(yù)處理方法進(jìn)行闡述。

1 蛋白質(zhì)沉淀法

在處理生物樣品時，首先要進(jìn)行的就是去除蛋白質(zhì)。去除蛋白質(zhì)有助于藥物從血漿蛋白中分離出來，便于測定藥物濃度；也可預(yù)防提取過程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成，增加樣品的檢測靈敏度。常用的去除蛋白質(zhì)的方法有溶劑解法、鹽析法、加入強(qiáng)酸或沉淀劑以及超濾法。

水溶性溶劑能使蛋白質(zhì)脫水，溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，從而使蛋白質(zhì)凝聚和沉淀。常見的水溶性有機(jī)溶劑有：乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等，使用體積為生物樣品體積的1～3倍。Yongjun Li等[3]在用UPLC-MS方法測定大鼠血漿中杜仲提取物的5種活性成分時，在100μL血漿樣品中加入50μL的1%甲酸溶液，用于促進(jìn)藥物從血漿蛋白中分離，后加入270μL的甲醇沉淀蛋白質(zhì)，15000r/min離心10min后吸取上清液。如果實驗中單一有機(jī)試劑達(dá)不到理想的沉淀效率時，也會將兩種試劑以一定體積比混合使用。Shuanghu Wang等[4]在用UPLC-MS方法測定大鼠血漿中的N-甲基金雀花堿時，在100μL血漿中加入200μL體積比為9∶1的乙腈-甲醇溶液作為沉淀劑，14900r/min離心10min，取上清液進(jìn)行分析，結(jié)果顯示N-甲基金雀花堿的平均回收率為86.1%～94.8%。Alexander Gaudl等[5]在對血漿中的類固醇激素進(jìn)行定量分析時，以2倍量的濃度為89μg/L的ZnSO4溶液與甲醇體積比為1∶4的混合溶液作為沉淀劑，14000r離心10min。

蛋白質(zhì)是多價的兩性電解質(zhì)，通常在酸性溶液中帶正電，在堿性溶液中帶負(fù)電。當(dāng)溶液pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)以陽離子形式存在，可與酸根陰離子形成不溶性鹽而沉淀。王寶蓮在150μL的比格犬血漿中加入50μL的20%三氯乙酸作為沉淀劑，14000r/min離心5min后取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析[6]。蛋白質(zhì)沉淀法簡便快速，重現(xiàn)性及回收率常較好，但待測物含量低時不適用。

2 液-液萃取法

2.1 液液萃取 液液萃取(Liquid-Liquid Etraction,LLE)是利用待測藥物與內(nèi)源性物質(zhì)在不同溶劑中溶解度的不同而進(jìn)行的液相分離技術(shù)。多數(shù)藥物是親脂性的，而血樣和尿樣中的大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)是極性較強(qiáng)的水溶性物質(zhì)。液液萃取方法操作簡單，且萃取1次即可除掉樣品中大部分的內(nèi)源性物質(zhì)，適用于藥物濃度較低的樣品。Lunhui Zhang等[7]在測定LS177在大鼠體內(nèi)的生物利用度時，對血藥濃度較低的口服組血漿采取液液萃取方法處理，而對血樣濃度較低的靜脈注射組采用蛋白質(zhì)沉淀法處理。同時，由于樣品的不同，溶劑的選擇對于萃取的回收率和選擇性有很大影響，在溶劑的選擇上，要根據(jù)待測藥物的極性，依據(jù)相似相溶原理對方法進(jìn)行優(yōu)化。Lunhui Zhang等[7]在萃取口服給藥組血漿時，分別用醚、乙酸乙酯、三氯甲烷以及甲基叔丁基醚作為萃取劑，最終采用具有最高提取效率和最低信噪比的甲基叔丁基醚作為萃取溶劑。結(jié)果顯示，各濃度口服給藥組的回收率均大于88.3%，基質(zhì)效應(yīng)在93.1%～95.1%范圍內(nèi)，內(nèi)源性物質(zhì)并沒有產(chǎn)生明顯干擾。Li Li等[8]通過改變萃取條件而對液液萃取的方法進(jìn)行優(yōu)化，開始使用乙酸乙酯直接萃取，結(jié)果顯示回收率較低。隨后對樣品進(jìn)行了酸化處理，分別使用磷酸鈉緩沖液(pH=3.2)和2%乙酸進(jìn)行處理比較，結(jié)果顯示在磷酸鈉緩沖液、2%乙酸以及空白對照品中藥物的回收率分別為65%、72%和43%。Man Liu等[9]在測定血漿中的依福地平時，在500μL血漿中加入200μL濃度為0.1mol/L的NaOH溶液，在堿性條件下用3mL體積比為20∶10∶1的正己烷-二氯甲烷-異丙醇混合溶劑進(jìn)行萃取，結(jié)果顯示該方法有較高的提取回收率及較好的方法重現(xiàn)性。

與簡便快速的蛋白質(zhì)沉淀方法相比，液液萃取為達(dá)到平衡要花費較長的時間，還要通過振搖等方式加快傳質(zhì)的進(jìn)行，并且可能會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，引起藥物損失，導(dǎo)致較低的回收率。液液萃取的優(yōu)點在于其選擇性，待測藥物能與大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)分離，得到更加干凈的分析物，尤其適用于非專屬性光譜分析。Xinchi Feng等[10]研究用LC-MS/MS快速測定大鼠血漿和組織勻漿中蒙花苷含量的方法時，采用蛋白質(zhì)沉淀和液液萃取兩種方法對樣品處理。首先蛋白質(zhì)沉淀法使用乙腈處理樣品，但分析樣品存在許多殘留的混合成分，該方法顯示出很明顯的基質(zhì)效應(yīng)，雖然可以通過稀釋樣品改善但靈敏度降低，最佳的蛋白質(zhì)沉淀方案的定量限為0.4μg/mL(線性范圍為0.4～200μg/mL)。為滿足定量限為0.001μg/mL的實驗要求，使用乙酸乙酯作為萃取劑對樣品進(jìn)行液液萃取，最終線性范圍為0.001～1.0μg/mL。另外蛋白質(zhì)沉淀法的回收率為83.8%～93.4%，液液萃取法的回收率為37.9%～53.1%，兩個方法均顯示出良好的重現(xiàn)性。

2.2 液相微萃取 液相微萃取(Liquid Phase Microextraction,LPME)是在LLE的基礎(chǔ)上發(fā)展的，屬于小型化的LLE，其凈化和預(yù)處理均優(yōu)于SPE。主要包括單滴液相微萃取(SDME)、中空纖維液相微萃取(HF-LPME)、電膜萃取(EME)以及分散液液微萃取等，其中應(yīng)用最廣泛的是HF-LPME。HF-LPME技術(shù)基于小體積水溶液的復(fù)合轉(zhuǎn)移，是以多孔中空纖維為微萃取溶劑(受體溶液)的載體[11-12]。

ROVERIF.L.等[13]建立液相微萃取(LPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(Gas Chromatograpty-Mass Spectrometet,GC-MS)結(jié)合鑒定和定量毛發(fā)樣品中苯巴比妥含量的方法。收集無藥頭發(fā)樣品并以50mg等分試樣分離，每個等分試樣用2.0mL的二氯甲烷在37℃下洗滌15min。將標(biāo)準(zhǔn)品和氘代內(nèi)標(biāo)物加入洗滌的頭發(fā)等分試樣中，并將樣品在70℃下用氫氧化鈉(NaOH)1.0mol / L完全消化15min，將溶解的樣品提交到LPME。萃取后，殘余物用四甲基氫氧化銨(TMAH)衍生化并通過GC-MS分析。

LPME技術(shù)在一個步驟中結(jié)合取樣，提取，分離和濃縮，同時保持分析物的相對高的富集因子，克服LLE分析時間長，溶劑消耗量大以及應(yīng)用程序的繁瑣性。LPME的應(yīng)用非常廣泛，包括從水樣中提取分析物，如有機(jī)物質(zhì)(農(nóng)藥，多環(huán)芳烴(PAH)，藥物和個人護(hù)理產(chǎn)品和硫化合物)以及無機(jī)物質(zhì)(砷(III)、砷(V)、釩和氟)。同時LPME技術(shù)也廣泛應(yīng)用于具復(fù)雜基質(zhì)的樣品，比如生物樣品，食物樣品和天然產(chǎn)物等[14]。

3 固相萃取法

3.1 固相萃取 固相萃取法(Solid-Phase Extraction,SPE)是利用相似相溶原理對藥物或雜質(zhì)進(jìn)行洗脫。在萃取過程中，固相對分析物的吸附力大于樣品基液，萃取時分析物被吸附在固體填料表面而其他樣品組分則通過柱子，然后分析物再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵撓聛?。SPE技術(shù)操作一般可分為4 步： 選擇SPE柱、裝柱、上樣、收集樣品[15]。

S. Magiera等[16]在測定尿液中的β阻斷劑，黃酮及異黃酮代謝物時，首先將尿樣與β-葡糖醛酸糖苷酶溫育進(jìn)行酶水解，過預(yù)先處理好的小柱，將體積比為4.5∶4.5∶1的甲基叔丁基醚、甲醇、甲酸的混合溶液作為流動相進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示回收率為70.20%～99.55%。Tomofumi Ohmori等[17]測定人血漿中八種β-內(nèi)酰胺類抗生素時，先將血漿與甲酸銨溶液混溶后過處理好的SPE柱，先用甲酸銨溶液沖洗，然后用1mL甲醇沖洗，結(jié)果顯示回收率為80.2%～98.6%。

SPE實際上是柱色譜分離的過程，分離原理類似于HPLC，但由于SPE柱的柱床較短，分離能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HPLC柱，主要用于樣品富集或?qū)Σ顒e較大的樣品進(jìn)行預(yù)分離。與前兩種預(yù)處理方式相比，SPE方法引入干擾物質(zhì)較少，能夠完全避免乳化的形成，在優(yōu)化條件下有較高的萃取率，適用于較少量的樣品，而由于SPE柱中萃取劑與樣品有很大的接觸面積，可以在短時間內(nèi)達(dá)到有效的萃取。

3.2 固相微萃取 固相微萃取技術(shù)(Solid-phase microextraction,SPME)Arthur和Pawliszyn于1990年開發(fā)的一種新的樣品制備技術(shù)，它使用在外部涂覆有適當(dāng)固定相的熔融石英纖維，從物理上講是一種改進(jìn)的注射器在其注射器針頭內(nèi)包含不銹鋼微管，這種微管具有約1cm的熔融石英纖維尖端，表面涂覆有有機(jī)聚合物，可以與注射器的柱塞一起前后移動[18]。SPME主要包括纖維針式固相微萃取(Fiber SPME)、管內(nèi)固相微萃取(In-tube SPME)以及攪拌棒吸附萃取(Stir bar sorptive extraction,SBSE)等，其中Fiber SPME技術(shù)最為常用，分為直接萃取和頂空萃取兩種類型。Kim M等[19]在使用頂空固相微萃取-GC-MS定量分析人血清中有機(jī)氯農(nóng)藥時，使用85μm的聚丙烯酸酯SPME萃取頭，將血清樣品在90℃條件下頂空萃取50 min。Mohammad T Jafari等[20]使用固相微萃取與電噴霧離子化離子淌度譜結(jié)合的方法對人尿和血漿中的抗抑郁藥文拉法辛進(jìn)行測定時，設(shè)計了專用的解析裝置，可以從萃取頭上把被分析物文拉法辛脫附到離子淌度譜儀器中進(jìn)行分析。

與常規(guī)的SPE相比，SPME允許將樣品制備的所有步驟組合到一個步驟中，從而減少樣品制備時間和有機(jī)溶劑的使用量，降低樣品處理成本。SPME在使用中經(jīng)常與各種儀器分析方法相結(jié)合，其中結(jié)合最多的儀器是氣相色譜儀，其次是液相色譜儀，但是有把SPME脫離色譜分離，直接和各種質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行快速分析的傾向[21]。

4 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technique,MIT)是通過簡單的聚合作用將分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)制備為高度交聯(lián)的有機(jī)聚合物或硅基材料。具體步驟是將模板分子與功能單體溶于大量的制孔劑溶液，兩者以氫鍵、離子鍵和范德華力等相互作用形成復(fù)合物，加入過量的交聯(lián)劑，后通過精確的引發(fā)劑引發(fā)聚合，固定模板分子，然后用適當(dāng)?shù)娜芤合礈炀酆衔镆猿ツ０宸肿雍臀错憫?yīng)的單體，最后獲得交聯(lián)的聚合物，MIP通過三維識別腔為靶分子提供高選擇性分子識別(過程如圖1所示)[22]。

分子印跡技術(shù)產(chǎn)生的聚合物基質(zhì)可以通過模板方法與功能單體及交聯(lián)劑的選擇而綁定結(jié)合靶分子或其類似物，具有有優(yōu)異的分子識別特性和高度的選擇性，被廣泛認(rèn)可。在治療藥物監(jiān)測領(lǐng)域中，已經(jīng)開發(fā)了用于樣品的預(yù)濃縮的印跡聚合物(MIP)，用于LC-MS分析的純化[23]。

Teresa Martinez-Sena等[24]在用液相色譜法測定水樣和尿樣中的非甾體抗炎藥含量時，使用基于MIP的SPE的方法進(jìn)行提取。研究對制造商推薦的MIP柱洗滌方法進(jìn)行了改進(jìn)，將乙腈與水的體積比由40:60改進(jìn)為40:100，在減少有毒溶劑使用的同時保持了提取物的清潔度。實驗結(jié)果顯示與常規(guī)C18柱提取相比，MIP柱選擇性更高，得到的提取物更為潔凈。

5 總結(jié)與展望

生物樣品處理的技術(shù)在不斷發(fā)展，對于生物分析物處理的方法也多種多樣，除了介紹的幾種常用方法外，還有微透析技術(shù)，柱切換技術(shù)以及超臨界流體萃取法等，也有很多聯(lián)用的技術(shù)方法，如固相萃取技術(shù)與超臨界流體萃取技術(shù)相結(jié)合，分子印跡技術(shù)與固相萃取技術(shù)相結(jié)合，這些方法出現(xiàn)豐富了生物樣品前處理和分析的手段。

無論技術(shù)原理如何，生物樣品處理和分析的目的都是為了實現(xiàn)準(zhǔn)確性和靈敏度的最優(yōu)化。實驗者應(yīng)依據(jù)生物分析的目的，樣品的性質(zhì)以及樣品中內(nèi)源性物質(zhì)的性質(zhì)來對處理技術(shù)進(jìn)行選擇，以求結(jié)果最大程度貼近理想狀態(tài)。然而，現(xiàn)有的生物前處理技術(shù)操作方法還是比較繁瑣，新的生物分析技術(shù)應(yīng)朝著小型化、自動化和高效化發(fā)展，以應(yīng)用于高通量的生物分析。

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PretreatmentofBiologicalSamplesforPharmaceuticalAnalysis

ZHANG Yachen HUANG Huoqiang*DU Lijie

Minzu University of China, Beijing 100081, China

Biological samples include plasma, tissue, urine and cells, which are characterized by the complex compositions and larger interference of substrate, so the biological samples pretreatment technology greatly affects the sensitivity and accuracy of experiment. This article summarized the characteristics, methods and application of commonly used techniques for biological sample processing, and prospected for future technological innovation.

Biological Samples; Protein Precipitation; Liquid-liquid Extraction; Solid-phase Extraction

R917

A

1007-8517(2017)19-0042-04

2017-08-08 編輯：陶希睿)

張亞琛(1992-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向為中藥化學(xué)。E-mail:xianshangzhiyin@163.com

黃火強(qiáng)(1982-)，男，漢族，博士研究生，副研究員，研究方向為中藥化學(xué)。E-mail:huanghuoqiang888@163.com