陳 堅(jiān)，段有發(fā)，葉志金，王麗京，章倩倩

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

研究報(bào)告

Mac-1基因缺失對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的影響

陳 堅(jiān)，段有發(fā)，葉志金，王麗京，章倩倩*

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

目的探討Mac-1缺失對(duì)黑色素瘤腫瘤生長(zhǎng)的影響。方法Mac-1基因敲除(Mac-1-/-)小鼠擴(kuò)群獲得實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量小鼠。設(shè)立對(duì)照組C57BL/6J小鼠和實(shí)驗(yàn)組Mac-1-/-小鼠，分別皮下注射B16-F10細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)小鼠生存率、測(cè)量腫瘤體積和重量，通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果Mac-1缺失后的黑色素瘤小鼠存活率較對(duì)照組C57BL/6J小鼠有顯著性差異(P﹤0.001)，腫瘤體積和重量較對(duì)照組C57BL/6J小鼠有顯著性差異(P﹤0.001)，腫瘤組織中增殖細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比較有顯著性差異(P﹤0.01)，并且腫瘤組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少。結(jié)論Mac-1基因缺失顯著抑制黑色素瘤腫瘤生長(zhǎng)。

Mac-1；黑色素瘤；腫瘤生長(zhǎng)

表面受體整合素CD11b/CD18，又稱(chēng)為巨噬細(xì)胞抗原-1(macrophage associated antigen-1，Mac-1)、補(bǔ)體受體3(CR3)或αMβ2，在髓系來(lái)源白細(xì)胞上表達(dá)豐富并介導(dǎo)其關(guān)鍵的黏附運(yùn)動(dòng)[1,2]。研究表明Mac-1的表達(dá)與腫瘤進(jìn)程有密切關(guān)系[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Mac-1缺失會(huì)降低髓系細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的募集，進(jìn)而減少腫瘤微環(huán)境中TNFα(tumor necrosis factor-α)含量，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，最終抑制腸道腫瘤的生長(zhǎng)[4]。說(shuō)明Mac-1可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。惡性黑色素瘤是一種由黑色素細(xì)胞發(fā)展而來(lái)的惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚組織，也可發(fā)生于眼、肺、消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴結(jié)等其他組織[5]。黑色素瘤的治療存活率普遍較低，尋找新的分子治療靶點(diǎn)將有望推動(dòng)黑色素瘤治療的進(jìn)展。目前Mac-1缺失對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的影響研究尚不明確，我們運(yùn)用Mac-1基因敲除小鼠建立皮下移植瘤模型，研究Mac-1基因缺失對(duì)黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的影響。為探討Mac-1作為研究黑色素瘤治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Mac-1敲除小鼠純合子(Mac-1-/-)，12只，雌性和雄性各6只，體重20～22 g，7周齡，購(gòu)于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室[B6.129S4-Itgamtm1Myd/J, stock No. 003991]。SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(C57，雌性，體重20～22 g)，23只，6～8周齡，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)[SCXK(粵)2013-0002]。無(wú)菌手術(shù)在廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行[SYXK(粵)2012-0125]。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)的操作均經(jīng)過(guò)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(ICUC)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)為：gdpulac2016]。

1.2細(xì)胞株

B16-F10黑色素瘤細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，37℃貼壁培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，待細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3主要試劑與儀器

胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Ki67抗體購(gòu)自基因科技有限公司；CD68抗體購(gòu)自Abcam公司；Omniscript? Reverse Transcription Kit購(gòu)自Qiagen公司；QuantiTect? SYBR? Green PCR Kit購(gòu)自Qiagen公司；獨(dú)立通氣籠IVC(蘇杭科技器材有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 異體移植黑色素瘤模型建立

Mac-1-/-小鼠飼養(yǎng)于溫度(25±3)℃，相對(duì)濕度40% ～60%，自動(dòng)光控時(shí)間12 h明/12 h暗的SPF級(jí)環(huán)境中。Mac-1-/-小鼠(8～12周齡)以雄∶雌=1∶3的比例配種，共配兩籠，母鼠懷孕后單獨(dú)飼養(yǎng)，記錄產(chǎn)仔日期和產(chǎn)仔數(shù)，3周齡時(shí)將仔鼠按照性別分籠飼養(yǎng)，并編號(hào)。

Mac-1-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)組，C57小鼠為對(duì)照組，各22只，雌性，6周齡。取指數(shù)生長(zhǎng)期B16細(xì)胞，胰酶消化后臺(tái)盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞數(shù)95%以上，用無(wú)菌生理鹽水將細(xì)胞稀釋后每只小鼠右上肢腋下皮下接種1×105個(gè)細(xì)胞(0.2 mL)。

1.4.2 腫瘤體積及重量的測(cè)定

從細(xì)胞注射后第10天開(kāi)始每組取10只小鼠，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(L)和短徑(W)直至第17天，并按照公式統(tǒng)計(jì)腫瘤的體積V=0.5236×(L×W2)。第17天測(cè)量完畢將小鼠處死，剝離腫瘤并稱(chēng)重。

1.4.3 小鼠生存率統(tǒng)計(jì)

剩余小鼠每天觀察生長(zhǎng)生活情況，記錄自然死亡時(shí)間統(tǒng)計(jì)小鼠生存率。

1.4.4 免疫組化染色

小鼠斷頸處死并分離腫瘤組織，10%中性福爾馬林固定過(guò)夜，石蠟包埋切片。4 μm厚切片脫蠟，脫水，并用10% BSA室溫封閉30 min。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗三次，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。然后在顯微鏡下觀察拍照。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Mac-1缺失對(duì)腫瘤組織中炎癥因子表達(dá)的影響

剪取50 mg腫瘤組織，于研缽中加入液氮研磨至粉狀，加1 mL Trizol，收集至1.5 mL離心管，靜置5 min。加入0.2 mL氯仿混勻，13 000 r/min 4℃離心15 min，吸取上層水相，加0.5 mL異丙醇混勻，沉淀10 min。13 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，加1 mL 75%乙醇混勻，7500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，20 μL DEPC水溶解，測(cè)定濃度。參考文獻(xiàn)方法，用Omniscript? Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄，QuantiTect? SYBR? Green PCR Kit進(jìn)行擴(kuò)增[6]。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s。熒光定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 3 min，95℃ 7 s、57℃ 10 s、72℃ 15 s 40個(gè)循環(huán)。按照文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行結(jié)果分析[7]，并對(duì)炎癥因子表達(dá)差異在2倍以上的進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1Mac-1-/-小鼠繁育結(jié)果

Mac-1-/-小鼠按照雄∶雌=1∶3比例配種，擴(kuò)大種群，平均每只母鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)為8只，共產(chǎn)仔50只。

2.2Mac-1基因敲除對(duì)黑色素瘤模型小鼠生存時(shí)間的影響

小鼠在接種B16腫瘤細(xì)胞后第7天觀察到體表明顯成瘤。成瘤后第10天開(kāi)始，每天觀察小鼠生活狀態(tài)，并記錄小鼠的死亡時(shí)間，繪制小鼠生存曲線圖(見(jiàn)圖1)。注射B16細(xì)胞后C57BL/6J小鼠在13周開(kāi)始出現(xiàn)死亡，在第27周時(shí)死亡率達(dá)100%；而Mac-1-/-小鼠則在15周時(shí)出現(xiàn)死亡，36周時(shí)死亡率達(dá)100%。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Mac-1-/-小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)，差異有顯著性(P< 0.001)。

圖1 皮下注射B16細(xì)胞后Mac-1-/-小鼠和C57BL/6J小鼠生存率(n=10)Fig.1 The survival rate of Mac-1-/- and C57BL/6J mice after subcutaneous injection of B16 cells

2.3Mac-1缺失對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的影響

分別在Mac-1敲除小鼠和C57小鼠右前肢皮下接種B16黑色素瘤細(xì)胞，10天后均形成可見(jiàn)瘤結(jié)節(jié)。成瘤后，每天測(cè)量移植瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算體積，并繪制出移植瘤生長(zhǎng)曲線(圖2)。C57小鼠移植瘤生長(zhǎng)較快，腫瘤體積由0.224 cm3增加到3.023 cm3；而Mac-1敲除小鼠移植瘤生長(zhǎng)較緩慢，腫瘤體積由0.062 cm3僅增加到1.108 cm3。與C57小鼠移植瘤相比，Mac-1敲除小鼠移植瘤體積減小，差異有顯著性(P<0.01)。

注：與C57組比較，** P< 0.01，***P< 0.001。圖2 Mac-1敲除小鼠皮下移植黑色素瘤生長(zhǎng)受到抑制(n=10)Note. Compared with the C57 group, ** P< 0.01，***P< 0.001.Fig.2 The tumor volume of Mac-1-/- mice was significantly inhibited compared with the C57BL/6J mice after subcutaneous injection of B16 cells

在接種腫瘤后第17天頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)∫浦擦龇Q(chēng)重。從圖3可見(jiàn)，C57小鼠移植瘤生長(zhǎng)較快，平均腫瘤重量為3.28 g，而Mac-1敲除小鼠移植瘤生長(zhǎng)較慢，平均腫瘤重量?jī)H為1.32 g。Mac-1敲除小鼠的腫瘤重量低于C57小鼠，差異有顯著性(P< 0.001)。

注：與C57組比較，***P< 0.001。圖3 Mac-1敲除小鼠皮下移植黑色瘤的重量受到抑制(n=9)Note. Compared with the C57 group, ***P<0.001.Fig.3 The tumor weight of Mac-1-/- mice was the significantly inhibited compared with the C57BL/6J mice after subcutaneous injection of B16 cells

2.4Mac-1缺失對(duì)黑色素瘤腫瘤細(xì)胞增殖的影響

對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)Mac-1缺失對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠腫瘤組織中，陽(yáng)性染色的增殖細(xì)胞較多，而Mac-1缺失的小鼠腫瘤組織中，PCNA(proliferating cell nuclear antigen)陽(yáng)性染色的增殖細(xì)胞較少。并且如圖4統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Mac-1缺失抑制小鼠腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的增殖，且差異有顯著性(P< 0.01)。

2.5Mac-1缺失對(duì)腫瘤組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

腫瘤組織中通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68進(jìn)行免疫組化染色。如圖5顯示，Mac-1缺失腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目較少，而C57對(duì)照組腫瘤組織中有大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。

注：與C57組比較，** P< 0.01。圖4 Ki67免疫組化染色Note. Compared with the C57 group, ** P< 0.01.Fig.4 Immunohistological staining for Ki67 in the tumor tissues

2.6Mac-1缺失對(duì)腫瘤組織中細(xì)胞因子的影響

通過(guò)對(duì)兩種小鼠腫瘤組織進(jìn)行總RNA提取，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)白細(xì)胞分泌的驗(yàn)證相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行篩選，對(duì)表達(dá)有2倍差異以上的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)Mac-1缺失后，皮下移植黑色素瘤內(nèi)細(xì)胞因子CXCL9(Cxc chemokine ligand-9)表達(dá)上調(diào)18倍，IFN-γ(interferon-γ)表達(dá)上調(diào)8.5倍(圖6)。

圖6 細(xì)胞因子表達(dá)Fig.6 Cytokine expression in the tumor tissues

3 討論

Mac-1是由α(CD11b)和β(CD18)兩個(gè)亞基以非共價(jià)鍵的方式締合而成的異二聚體，表達(dá)于白細(xì)胞表面參于機(jī)體防御及免疫反應(yīng)的重要粘附分子，其主要影響白細(xì)胞粘附和遷移出內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞，到達(dá)炎癥部位介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[2]。Ahn等[8]證實(shí)抑制Mac-1的表達(dá)能減少白細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的募集，減弱腫瘤的抗輻射能力。并且，Mac-1陽(yáng)性白細(xì)胞大量分泌MMP9(matrix metalloproteinase-9)促進(jìn)腫瘤血管新生[9]。Spicer等[10]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞通過(guò)Mac-1/ICAM-1與腫瘤細(xì)胞黏附，協(xié)助腫瘤轉(zhuǎn)移。我們前期研究表明，Mac-1陽(yáng)性白細(xì)胞在結(jié)腸癌組織中大量浸潤(rùn)，缺失Mac-1能夠抑制結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)[4]。本研究應(yīng)用Mac-1基因敲除小鼠建立移植瘤模型，探討Mac-1缺失對(duì)惡性黑色素瘤腫瘤生長(zhǎng)的影響。發(fā)現(xiàn)Mac-1缺失可以抑制黑色素瘤腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞增殖，并且腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目減少。說(shuō)明Mac-1缺失可能通過(guò)抑制腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

黑色素瘤是一種惡性程度較高的腫瘤，多發(fā)生于皮膚。其預(yù)后效果差，易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)使得患者不能順利地治愈。Li[11]團(tuán)隊(duì)最近發(fā)現(xiàn)抑制髓樣細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的募集能有效提高黑色素瘤免疫治療。腫瘤的發(fā)展與髓樣細(xì)胞的激活密切相關(guān)，其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)為腫瘤生長(zhǎng)提供了所需的因子[12]。TAM是浸潤(rùn)在腫瘤組織中最多的白細(xì)胞，分泌多種炎癥因子調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)，因此我們主要檢測(cè)腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。根據(jù)巨噬細(xì)胞的活化類(lèi)型及其在腫瘤微環(huán)境中的不同作用，TAM主要分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。IFN-γ刺激M1型巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)一氧化氮合酶和CXCL9等因子的表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。而M2型巨噬細(xì)胞主要促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。我們研究結(jié)果顯示，Mac-1缺失后IFN-γ和CXCL9表達(dá)升高。同時(shí)Keane[13]，Alshaker[14]等研究表明CXCL-9及IFN-γ能減弱血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。提示雖然腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目減少，但是可能是浸潤(rùn)的M2型巨噬細(xì)胞減少，而M1型巨噬細(xì)胞增多，抑制了腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)腫瘤具有殺傷作用的CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞可以分泌IFN-γ，但是這兩種白細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)情況，以及IFN-γ升高是否由于這兩種白細(xì)胞分泌尚不清楚，我們將進(jìn)一步在今后的研究中深入探討。

綜上所述，Mac-1基因的缺失能夠抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)，可能是通過(guò)促進(jìn)IFN-γ分泌增加M1型、減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤(rùn)，促進(jìn)CXCL9分泌，進(jìn)而抑制抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究對(duì)Mac-1作為臨床治療腫瘤靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)具有重要理論指導(dǎo)意義。

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EffectofMac-1deficiencyonthetumorgrowthofmelanomainmice

CHEN Jian， DUAN You-fa， YE Zhi-jin， WANG Li-jing， ZHANG Qian-qian*

(Institute of Vascular Biology, School of Basic Course, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo explore the influence ofMac-1 deficiency on tumor growth of melanoma.MethodsThe population ofMac-1 gene knock-out (Mac-1-/-) mice was expanded. B16-F10 cells were subcutaneously injected into the C57BL/6J mice (control group) andMac-1-/-mice (experiment group), respectively. Subsequently,the survival rate, tumor volume and body weight were recorded. The proliferation and infiltration of macrophages were detected by immunohistochemistry.ResultsThe survival rate ofMac-1-/-mice was significantly improved compared with the C57BL/6J mice (P﹤0.001). The tumor volume and body weight were remarkably decreased in theMac-1-/-mice compared with the control group (P﹤0.001). Meanwhile, the tumor cell proliferation index was decreased in theMac-1-/-mice compared with the control group (P﹤0.01).Furthermore, the infiltration of macrophages in the tumor tissues was also decreased in Mac-1-/-tumor mice compared with control group.ConclusionsMac-1 gene deletion can significantly suppress melanoma growth.

Mac-1; Melanoma; Tumor growth; Mice

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0023-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.005

2016-12-16

國(guó)家自然科學(xué)基金(31712904)；廣東省科技計(jì)劃(2015A030302083)；廣東省優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃(YQ2015100)；廣州市珠江科技新星(201610010045)。

陳堅(jiān)(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：腫瘤藥理，模式動(dòng)物疾病模型。E-mail: chenjian_ivory@163.com

章倩倩(1981-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤藥理，模式動(dòng)物疾病模型。E-mail: vinny223@126.com