王 亮，楊 芳，回斯美，周子娟，陳 軍，詹紅微，陳大朋，王靖宇

(大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，遼寧 大連 116044)

芍藥苷抑制肌球蛋白輕鏈激酶緩解腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂

王 亮，楊 芳，回斯美，周子娟，陳 軍，詹紅微，陳大朋，王靖宇

(大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，遼寧 大連 116044)

目的考察芍藥苷對腫瘤壞死因子α(TNF-α) 所致Caco-2模擬的腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，采用MTT法研究芍藥苷對Caco-2細(xì)胞活性的影響; 建立TNF-α所致Caco-2細(xì)胞的屏障功能紊亂模型，研究芍藥苷對屏障功能的影響。結(jié)果TNF-α孵育Caco-2細(xì)胞，明顯降低了Caco-2細(xì)胞屏障的跨膜電阻，肌球蛋白輕鏈激酶 (MLCK) 表達(dá)明顯增加，緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1表達(dá)明顯下降，提示Caco-2細(xì)胞屏障功能紊亂；芍藥苷明顯逆轉(zhuǎn)TNF-α所造成的Caco-2細(xì)胞屏障功能紊亂，即抑制MLCK的表達(dá)，促進(jìn)緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)，芍藥苷的這種保護(hù)細(xì)胞屏障的作用可被MLCK的小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)所阻斷。結(jié)論芍藥苷可明顯緩解TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障功能紊亂，該作用與降低MLCK, 促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá)有關(guān)。

潰瘍性結(jié)腸炎；芍藥苷；腫瘤壞死因子α；Caco-2細(xì)胞；腸上皮屏障；肌球蛋白輕鏈激酶

炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)為腸道炎癥性疾病，表現(xiàn)為正常通過腸道的內(nèi)容物即可刺激腸黏膜屏障，誘發(fā)黏膜免疫功能失調(diào)，伴隨反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性反應(yīng)，臨床分型主要包括克羅恩病(Crohn′s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)[1]。隨著生活水平的提高，IBD在我國的發(fā)病率以及確診率近些年來明顯增加[2]。IBD可影響青少年身體發(fā)育，中重度結(jié)腸炎患者結(jié)腸癌罹患率明顯增加，嚴(yán)重危害人們健康[1]。IBD的具體病理機(jī)制尚未闡明，研究表明腸道黏膜屏障功能紊亂是IBD非常重要的病理機(jī)制之一，維持黏膜屏障的穩(wěn)定性對于IBD癥狀的緩解以及治療具有重要的意義[3]。

芍藥湯是中藥中對腸道炎癥性疾病具有治療作用的經(jīng)典中藥復(fù)方，芍藥是芍藥湯中一味重要的中藥[4]。芍藥苷是芍藥中的主要活性組分之一，分子式C23H28O11，分子質(zhì)量為480.4[5-6]。芍藥苷具有廣泛的藥理學(xué)活性，比如降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等[7]。鑒于芍藥湯對IBD良好的治療作用，本文擬考察作為芍藥湯中重要組分的芍藥苷，對腸上皮細(xì)胞屏障功能的保護(hù)作用，初步探索其相應(yīng)的機(jī)制。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是腸道上皮細(xì)胞增殖和凋亡的主要促炎因子，是IBD發(fā)生的重要致病因子。因此，本研究通過考察芍藥苷的安全使用劑量，觀察其對TNF-α所致Caco-2模擬腸上皮細(xì)胞屏障功能損傷的緩解作用，考察芍藥苷對腸上皮細(xì)胞緊密連接功能紊亂的致病因子——肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的影響，以探究芍藥苷對上皮細(xì)胞屏障功能損傷保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2試劑芍藥苷(純度≥98%)購自阿拉丁試劑有限公司；TNF-α購自Sigma公司；抗MLCK抗體、緊密連接蛋白o(hù)ccludin與ZO-1抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗，均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3儀器上海精科紫外可見分光光度計；蔡司倒置顯微鏡；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀等購自大連捷邁步；美國Millipore Millicell-ERS細(xì)胞電阻儀。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中含105U·L-1青霉素、105U·L-1鏈霉素。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋80%，采用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，根據(jù)具體實驗要求，改變相應(yīng)密度，接種于培養(yǎng)板中，進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2MTT檢測芍藥苷對Caco-2細(xì)胞的作用首先考察芍藥苷對正常Caco-2細(xì)胞活力的作用，借此選擇合適的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)研究。收集對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，在96孔板中，給予不同終濃度的芍藥苷(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)分別處理24 h后，棄上清，PBS洗滌各孔3次。棄去PBS，更換成MTT(5 mg·L-1)工作液100 μL，孵育4 h后，加入100 μL DMSO，微孔振蕩器上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測570 nm下的吸光度值。細(xì)胞生存率/%=各組吸光度值/空白組吸光度值×100%。

2.3Caco-2細(xì)胞屏障跨膜電阻測定[8]Caco-2單層細(xì)胞于Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)，采用歐姆表檢測小室內(nèi)外兩側(cè)電阻差值即為跨膜電阻(transmembrane resistance，TER)。Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)20 d后，跨膜電阻電阻差值穩(wěn)定，大約為300 Ω/cm2左右。用跨膜電阻來表征腸上皮屏障功能，跨膜電阻越小，表明腸上皮屏障損傷越嚴(yán)重。

2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑，將含有靶向干擾MLCK的siRNA的質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Caco-2 細(xì)胞。MLCK的siRNA 序列為:5′-CGTACGCGGAATACTTCGA-3′。

2.5Westernblot檢測Caco-2細(xì)胞處理后，冰浴裂解細(xì)胞，經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量，后經(jīng)SDS-PAGE 進(jìn)行電泳。電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，用相應(yīng)蛋白抗體(根據(jù)抗體說明書選擇合適的稀釋濃度)孵育過夜，再以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h后，ECL顯影，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1芍藥苷對小腸上皮細(xì)胞Caco-2活力的影響芍藥苷 (5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)孵育Caco-2細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率如Fig 1所示。芍藥苷在40 μmol·L-1以下濃度對細(xì)胞存活率沒有明顯的影響，因此，本研究選擇5、10、20 μmol·L-1芍藥苷進(jìn)行后續(xù)研究。

Fig 1 Effect of paeoniflorin on viability of Caco-2 cells(n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2TNF-α對Caco-2細(xì)胞屏障功能的影響TNF-α(5、10、20 μg·L-1)分別孵育Caco-2細(xì)胞12、24 h，檢測跨膜電阻變化。如Fig 2所示，10 μg·L-1TNF-α孵育Caco-2細(xì)胞24 h，可明顯降低Caco-2細(xì)胞屏障跨膜電阻，又不至于破壞嚴(yán)重。因此，本研究采用10 μg·L-1TNF-α孵育Caco-2細(xì)胞24 h模擬屏障損傷，進(jìn)行后續(xù)研究。

Fig 2 Effect of TNF-α on transmembrane resistance(TER) of Caco-2 cell barrier function(n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.3芍藥苷對TNF-α降低Caco-2細(xì)胞屏障跨膜電阻的作用如Fig 3所示，相對于對照組，10 μg·L-1TNF-α可明顯降低Caco-2細(xì)胞屏障跨膜電阻，說明屏障通透性增加，屏障功能紊亂。5、10、20 μmol·L-1芍藥苷可逆轉(zhuǎn)TNF-α的作用，其跨膜電阻隨著芍藥苷濃度增加而逐步增加。

Fig 3 Effect of paeoniflorin on TNF-α induced reductionof TER in Caco-2 cells(n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTNF-α

3.4芍藥苷對緊密連接蛋白的影響如Fig 4所示，相對于正常對照組，TNF-α可明顯降低緊密連接蛋白的表達(dá)，occludin和ZO-1表達(dá)均明顯下降，表明TNF-α可通過降低緊密連接蛋白含量，誘發(fā)上皮細(xì)胞屏障功能紊亂。5、20 μmol·L-1芍藥苷可劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)TNF-α導(dǎo)致的緊密連接蛋白表達(dá)下降，恢復(fù)上皮屏障功能。

Fig 4 Paeoniflorin reversed TNF-α induced reduction of tight junction proteins(n=6)

A:Effect of paeoniflorin on TNF-α induced reduction of occludin;B:Effect of paeoniflorin on TNF-α induced reduction of ZO-1.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α

3.5芍藥苷抑制MLCK緩解上皮屏障功能紊亂如Fig 5A所示，相對于正常對照組，10 μg·L-1TNF-α可明顯增加MLCK表達(dá)，導(dǎo)致黏膜屏障緊密連接功能紊亂;5、20 μmol·L-1芍藥苷呈劑量依賴性抑制TNF-α引起的MLCK高表達(dá)。如Fig 5B所示，芍藥苷可以明顯逆轉(zhuǎn)TNF-α造成的黏膜屏障紊亂，表現(xiàn)為芍藥苷可以抑制TNF-α導(dǎo)致的跨膜電阻下降，而這種逆轉(zhuǎn)保護(hù)作用可被針對MLCK的siRNA明顯阻斷。結(jié)果表明，MLCK可能是芍藥苷逆轉(zhuǎn)TNF-α導(dǎo)致屏障功能紊亂的藥物靶點。

Fig 5 Effects of paeoniflorin on TNF-αinduced high expression of MLCK(n=6)

A:Paeoniflorin inhibited TNF-α induced high expression of MLCK;B:Effects of siRNA of MLCK on paeoniflorin induced increase in TER.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α

4 討論

本研究考察了芍藥苷對TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞屏障功能紊亂的保護(hù)作用和相應(yīng)機(jī)制。芍藥苷在5～20 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，可明顯逆轉(zhuǎn)TNF-α造成的屏障功能紊亂，包括增加跨膜電阻值、增加緊密連接蛋白表達(dá)、抑制MLCK表達(dá)。

IBD目前的病理機(jī)制尚未闡明，腸上皮屏障功能紊亂是IBD的重要發(fā)病機(jī)制[9-10]。腸上皮屏障功能紊亂會增加腸通透性，進(jìn)而會誘發(fā)和加重炎性腸病[11]。腸上皮細(xì)胞能分泌多種受體，可以與細(xì)胞因子結(jié)合，參與免疫級聯(lián)反應(yīng)，加重炎癥反應(yīng)[10]。有研究表明[12]，腸上皮中包含潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞。潘氏細(xì)胞的缺失會增加IBD患病率，完整狀態(tài)的腸上皮屏障還可以有效防止腸道病原菌的侵襲。腸上皮屏障功能紊亂會加重腸道免疫反應(yīng)，破壞腸道菌群的平衡。鑒于腸上皮屏障在IBD中的重要作用，探索緩解上皮屏障功能紊亂的方法是研究治療IBD的重要方向[11]。TNF-α是一種促炎因子[13]，可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂，從而增加腸道上皮細(xì)胞通透性。因此，本研究采用TNF-α體外制備上皮細(xì)胞屏障功能紊亂模型，考察芍藥苷對上皮細(xì)胞屏障功能紊亂的作用。TNF-α可促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞MLCK表達(dá)，MLCK過表達(dá)可導(dǎo)致緊密連接蛋白的表達(dá)下降，誘發(fā)和加重腸上皮屏障紊亂[13]。

本研究通過體外研究證實，芍藥苷可以明顯改善TNF-α所造成腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂，MLCK可能是芍藥苷的潛在靶點。MLCK的siRNA可明顯抑制芍藥苷對腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂的保護(hù)作用，進(jìn)一步證實MLCK是芍藥苷潛在的靶點。本研究為IBD的治療提供了一定的科學(xué)參考，但是基于MLCK在不同組織以及細(xì)胞具有廣泛分布的特點，應(yīng)用芍藥苷抑制MLCK治療IBD，其潛在的副作用也是以后研究的重要方向。在以后的研究中，如何增加芍藥苷對不同組織細(xì)胞中MLCK的選擇性，也非常重要。

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PaeoniflorinalleviatesTNF-αinducedintestinalbarrierdysfunctionbyinhibitionofMLCK

WANG Liang, YANG Fang, HUI Si-mei, ZHOU Zi-juan, CHEN Jun, ZHAN Hong-wei, CHEN Da-peng, WANG Jing-yu

(AnimalExperimentCentre,DalianMedicalUniversity,DalianLiaoning116044,China)

AimTo investigate the protective effect of paeoniflorin on TNF-α induced intestinal epithelial barrier dysfunction and its mechanisms.MethodsThe Caco-2 cells were cultured and the MTT assay was used to determine the effects of the paeoniflorin on Caco-2 cell activity. The Caco-2 cell intestinal epithelial barrier dysfunciton model was established through incubation of cells with TNF-α. The effects of paeoniflorin on intestinal epithelial barrier dysfunciton were studied.ResultsThe transmembrane resistance in Caco-2 epithelial barrier was significantly reduced by TNF-α incubation; MLCK significantly increased, while tight junction protein occludin and ZO-1 significantly decreased by TNF-α. These changes were significantly reversed by paeoniflorin, which reduced MLCK expression and enhanced expression of occludin and ZO-1. The protective effects against epithelial barrier dysfunction could be abrogated by small interfering RNA(siRNA) of MLCK.ConclusionsPaeoniflorin alleviates the epithelial barrier dysfunction induced by TNF-α through down-regulation of MLCK and enhancement of tight junction protein occludin and ZO-1. This study supplies a potential candidate drug for the clinical treatment of inflammatory bowel diseases.

ulcerative colitis; paeoniflorin; tumor necrosis factor alpha; Caco-2 cells; intestinal epithelial barrier; myosin light chain kinase

A

1001-1978(2017)11-1541-05

R284.1；R322.45；R329.24；R345.57；R574.022

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.026.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.013

2017-07-09，

2017-08-12

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81600440，31272392)

王 亮(1980 -)，男，碩士，講師，研究方向：比較醫(yī)學(xué)，E-mail：wangliang_dl@163.com； 陳大朋(1987-)，男，博士，講師，研究方向：胃腸病藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：cdp.9527@163.com； 王靖宇(1964-)，男，博士，教授，研究方向：實驗動物與動物行為學(xué)，通訊作者，E-mail：wangjingyus@163.com