張閃閃，李天一，王曉琴，張 波,2

(1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，2. 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在三氧化二砷抑制HL-60增殖過程中的效應(yīng)機(jī)制

張閃閃1，李天一1，王曉琴1，張 波1,2

(1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，2. 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

目的探究三氧化二砷(ATO)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效應(yīng)機(jī)制，為掌控急性早幼粒白血病治療藥物監(jiān)測提供間接藥理學(xué)指標(biāo)。方法通過ATO的毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián)基因數(shù)據(jù)整理建立蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，使用MCODE算法對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)潢P(guān)系聚類分析尋找關(guān)聯(lián)基因群；采用HL-60細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。MTT法評價ATO對HL-60的細(xì)胞毒活性；Real-time PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)變化；Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平；用ER-Tracker Red對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行特異性熒光染色；流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞分化及凋亡指標(biāo)變化。結(jié)果ATO相關(guān)的206個基因PPI網(wǎng)絡(luò)中有3 794對關(guān)系，排名前4的基因群中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模塊凸顯；ATO能抑制HL-60細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性；ATO在給藥4 h即可引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，GRP78和GRP94表達(dá)較明顯，隨著時間延長基因表達(dá)水平變化明顯，1～4 μmol·L-1引起GRP78、GRP94和Nrf2表達(dá)，8 μmol·L-1引起CHOP大量表達(dá)。ATO在1、2 μmol·L-1時引起eIF2α蛋白磷酸化水平增加，在8 μmol·L-1時誘導(dǎo)CHOP蛋白大量表達(dá)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色結(jié)果顯示，4、8 μmol·L-1的ATO誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹；流式結(jié)果表明ATO在1 μmol·L-1時引起細(xì)胞分化，在2 μmol·L-1時出現(xiàn)明顯分化群，4、8 μmol·L-1時細(xì)胞分化同樣明顯，但在8 μmol·L-1時細(xì)胞同時出現(xiàn)凋亡群。結(jié)論ATO抑制HL-60細(xì)胞增殖過程中出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并呈濃度依賴性階段性切換效應(yīng)。

急性早幼粒細(xì)胞白血?。蝗趸?；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；分化；凋亡；MCODE算法

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種以增殖/分化解偶聯(lián)異常為特征的疾病。砷劑作為白血病治療藥物，其臨床有效性已經(jīng)得到公認(rèn)，但毒性反應(yīng)及耐藥性等問題也不容忽視。臨床靜脈給藥劑量5～10 mg·d-1，會引起白細(xì)胞增多、胃腸功能紊亂和呼吸困難，嚴(yán)重時會導(dǎo)致分化綜合征和心電圖異常[1-2]。在治療過程中，經(jīng)常會因?yàn)榀熜Ф鲆曀幬锒拘运鶐淼牟涣甲饔?，在療效與毒性之間是否存在臨界濃度是值得思考的問題。

三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)可通過3種主要機(jī)制作用于AML細(xì)胞，包括誘導(dǎo)分化和(或)凋亡、生長抑制和血管生成抑制。其中誘導(dǎo)分化或凋亡是最為常見兩種藥效，二者在濃度、時間上呈現(xiàn)量質(zhì)關(guān)系依賴，而對于何種機(jī)制引起的藥效切換少有關(guān)注。

細(xì)胞存活很大程度上取決于蛋白質(zhì)的正確產(chǎn)生、控制和折疊。為了保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激刺激積累導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞主要依賴于未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的細(xì)胞保護(hù)網(wǎng)絡(luò)[3]，但當(dāng)應(yīng)激過強(qiáng)時，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能作為細(xì)胞分化向凋亡切換的效應(yīng)機(jī)制存在。因此，本文擬以急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)HL-60細(xì)胞為模型，同時基于毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫的比較基因組學(xué)方法(comparative toxicogenomics database，CTD)，尋找關(guān)鍵基因群，研究ATO抑制HL-60細(xì)胞增殖過程中出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并呈現(xiàn)濃度依賴性階段性切換效應(yīng)，為白血病治療藥物監(jiān)測提供間接藥理學(xué)指標(biāo)。

1 材料

1.1細(xì)胞人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2藥物與試劑三氧化二砷(ATO，純度98%)，美國Sigma公司；胎牛血清，美國Biological Industries公司；IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基，Gibco公司；MTT，北京索萊寶公司；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1、FITC Mouse Anti-Human CD14，BD Biosciences公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒、引物，上海生工生物工程有限公司；SYBR Green PCR kit，Qiagen公司；β-actin抗體，中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BiP、CHOP、p-eIF2α、eIF2α和Histone H3抗體，Cell Signaling Technology；ER-Tracker Red試劑盒，碧云天生物公司。

1.3儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo3131)，美國Thermo公司；超凈工作臺(ZHJH 1112B)，上海智誠分析儀器有限公司；正置熒光顯微鏡(ZEISS Imager. M2)，德國ZEISS公司；倒置生物顯微鏡(BDS200-PH)，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀(Thermo 3001)，美國Thermo公司；低溫離心機(jī)(5424)，德國Eppendorf公司；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)，美國BD公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)HL-60細(xì)胞用含20%胎牛血清、青霉素(終濃度100 kU·L-1)及鏈霉素(終濃度100 mg·L-1)的IMDM培養(yǎng)液(pH=7.5)在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行各項實(shí)驗(yàn)。

2.2ATO相關(guān)基因篩選及分析從CTD數(shù)據(jù)庫[4](http://ctdbase.org/)獲得ATO相關(guān)基因3 259個，根據(jù)物種篩選出206個人類相關(guān)基因，對這些基因進(jìn)行String(http://string-db.org/)分析，獲得基因互作關(guān)系，進(jìn)而在Cytoscape(Version：3.2.0)中做出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，隨后運(yùn)用MCODE算法[5]分析網(wǎng)絡(luò)子模塊。MCODE算法是一種基于密度的非交疊式聚類算法。該算法以種子節(jié)點(diǎn)為中心進(jìn)行擴(kuò)展，在其鄰居節(jié)點(diǎn)中尋找滿足要求的節(jié)點(diǎn)，從而形成一個功能模塊。

2.3細(xì)胞抑制率的測定96孔培養(yǎng)板上每孔接種4×104個細(xì)胞，培養(yǎng)液體積為200 μL，分別加入不同濃度的ATO，藥物終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1，每組設(shè)6個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r·min-1離心10 min棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測570 nm處每孔的吸光度(OD)值，按下式公示計算細(xì)胞增殖抑制率[6]：

2.4Real-timePCR檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)分別用ATO(0、1、2、4、8 μmol·L-1)處理細(xì)胞4、8、24 h。使用UNIQ 10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒提取RNA，檢測定量RNA水平及含量，并用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR檢測系統(tǒng)條件為：95℃ 15 s；60℃ 45 s；45個循環(huán)[7]。引物序列見Tab 1。

2.5Westernblot法檢測蛋白表達(dá)收集ATO各處理組(0、1、2、4、8 μmol·L-1)細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗2遍，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清。蛋白經(jīng)煮沸處理后，各組取30 μg蛋白樣品，經(jīng)10% SDS PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印PVDF膜，加入一抗，4℃過夜，次日以TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h；以TBST洗膜4次，每次5 min，加入ECL顯色液，經(jīng)免疫印跡成像系統(tǒng)顯影檢測目的蛋白[8]。

Tab 1 Primer sequence

Tab 2 MCODE scoring for PPI network

2.6內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性熒光染色收集ATO各處理組(0、2、4、8 μmol·L-1)細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞，離心去除洗滌液，加入配制好并37℃預(yù)溫育的ER-Tracker Red染色工作液(稀釋比例為1 ∶1 000)，與細(xì)胞37℃共孵育15～30 min。去除ER-Tracker Red染色工作液，用PBS洗滌細(xì)胞1～2次，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察[9]。

2.7流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞分化率取對數(shù)期HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108·L-1，分別加入不同濃度的ATO，藥物終濃度分別為0、1、2、4、8 μmol·L-1，孵育72 h后收集細(xì)胞，用冷PBS洗2次，加100 μL鞘液將細(xì)胞懸起，依次加入20 μL CD11b、CD14熒光抗體，混勻，室溫、避光、反應(yīng)20 min。300×g離心5 min棄上清，每管加入1 mL鞘液將細(xì)胞懸起，300×g離心5 min棄上清，加0.5 mL鞘液混勻，4℃避光，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，用CELL Quest Pro軟件分析數(shù)據(jù)[10]。

2.8流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率取對數(shù)期HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5 ×108·L-1，分別加入不同濃度的ATO，藥物終濃度分別為0、1、2、4、8 μmol·L-1，孵育48 h后收集細(xì)胞，用冷PBS洗2次，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V和PI，混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，用CELL Quest Pro軟件分析數(shù)據(jù)[11]。

3 結(jié)果

3.1MCODE算法對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)潢P(guān)系聚類分析將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行MCODE分析，結(jié)果見Tab 2。該算法優(yōu)于其他圖形聚類方法，既可以對感興趣的聚類進(jìn)行定向的微調(diào)而不考慮網(wǎng)絡(luò)中的其余部分，又允許檢查與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的聚類互連性。其核心思想是以局部密度所定義的adhoc網(wǎng)絡(luò)為根據(jù)，分離局部稠密區(qū)域。共有6個集群被提取出來，并給出了相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。我們對每個集群進(jìn)行功能聚類，發(fā)現(xiàn)前兩個集群中的基因與凋亡、增殖和分化密切相關(guān)[1,12](Fig 1)。PML、RARA、CEBPB、HMOX1與APL細(xì)胞的分化相關(guān)，CASP3、BCL2、BCL2L1與APL細(xì)胞凋亡相關(guān)，MAPK8、CDK1、MAPK1、MAPK9、MAPK14與APL細(xì)胞增殖相關(guān)。第3個集群中的基因全部與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)(Fig 1)，ATF6、NFE2L2、ATF4、XBP1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路上的重要基因，在前兩個集群中同樣存在重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因，如EIF2AK3和EIF4E。

Fig 1 Protein-protein interaction networkof ATO and three MCODE modules

A:ATO all related genes;B:The first cluster, score was 45.051;C:The second cluster, score was 8.762;D:The third cluster, score was 4

3.2ATO抑制HL-60細(xì)胞增殖ATO對HL-60細(xì)胞24 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為14.8 μmol·L-1，抑制作用隨ATO濃度增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(Fig 2)。ATO濃度為10 μmol·L-1時，對HL-60細(xì)胞的抑制率為33.9%，大于此濃度時抑制率呈快速上升趨勢?；诒緦?shí)驗(yàn)，研究后續(xù)選擇ATO 10 μmol·L-1以下的較小濃度。

Fig 2 Inhibitory rate of ATO on HL-60cells after treatment of 24 h(±s,n=3)

**P<0.01vscontrol

3.3ATO對HL-60細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響不同濃度ATO處理HL-60細(xì)胞4 h時，GRP94有不同程度的上調(diào)，在1 μmol·L-1時上調(diào)比率較高。當(dāng)作用時間延長至8 h時，GRP78和GRP94在ATO 2 μmol·L-1時上調(diào)明顯，而CHOP在ATO 4、5 μmol·L-1時上調(diào)明顯。在24 h時，GRP78在ATO 4 μmol·L-1時上調(diào)明顯，而CHOP在ATO 8 μmol·L-1時上調(diào)明顯。Nrf2在處理4 h時上調(diào)明顯，8、24 h時也有上調(diào)，但上調(diào)倍率不及4 h，且都在較低濃度時上調(diào)明顯(Fig 3)。

Fig 3 Changes of GRP78, GRP94, CHOP and Nrf2 mRNAexpression levels after ATO treatment at different concentrations and time assessed by real-time PCR(±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.4ATO對HL-60細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響ATO處理HL-60細(xì)胞24 h時，GRP78在ATO 4 μmol·L-1時上調(diào)最為明顯，p-eIF2α在ATO 1、2 μmol·L-1時上調(diào)明顯，CHOP在ATO 8 μmol·L-1時上調(diào)明顯(Fig 4)。

3.5ATO引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹的量效關(guān)系由Fig 5可知，空白組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常，熒光分布在細(xì)胞外圍。2 μmol·L-1的ATO處理細(xì)胞后可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輕微腫脹，導(dǎo)致細(xì)胞中心熒光強(qiáng)度增加，ATO 4 μmol·L-1可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的異常擴(kuò)張和腫脹，導(dǎo)致整個細(xì)胞充滿熒光，或可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，呈小的堆疊塊狀。ATO 8 μmol·L-1時同時可見細(xì)胞形態(tài)的改變。

3.6ATO對HL-60細(xì)胞分化影響的量效關(guān)系

Fig 4 Changes of GRP78, p-eIF2αand CHOP protein expression levels after ATO treatment atdifferent concentrations assessed by Western blot(±s，n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 5 The morphological changeof endoplasmic reticulum in HL-60 cells afterATO treatment by fluorescence microscope(×100)

A:ATO 0 μmol·L-1;B:ATO 2 μmol·L-1;C:ATO 4 μmol·L-1;D:ATO 8 μmol·L-1

由Fig 6可知，1 μmol·L-1的ATO處理細(xì)胞72 h后分化已經(jīng)發(fā)生，在ATO 2 μmol·L-1時CD11b的表達(dá)上升明顯，且出現(xiàn)明顯分群，其各特征細(xì)胞群聚集程度高。ATO 4、8 μmol·L-1時CD11b表達(dá)同樣明顯。

3.7ATO對HL-60細(xì)胞凋亡影響的量效關(guān)系由Fig 7可知，ATO誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡呈藥物濃度依賴性變化。8 μmol·L-1的ATO處理細(xì)胞48 h后，凋亡率較空白組上升最為明顯。

4 討論

APL是造血組織的惡性疾病，其特征是形態(tài)異常的早幼粒細(xì)胞增生。ATO作為治療APL的臨床有效藥，治療窗窄，尋找藥效學(xué)臨界點(diǎn)的藥理學(xué)依據(jù)對于控制不良反應(yīng)的發(fā)生有重要價值。

UPR是一種促生存反應(yīng)，減少未折疊蛋白的積累并恢復(fù)正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。蛋白質(zhì)持續(xù)聚集則信號從促存活轉(zhuǎn)換到促凋亡。早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會經(jīng)PERK作用使位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)的eIF2α蛋白磷酸化，抑制蛋白合成，促使ATF4的翻譯能夠通過替代性eIF2α非依賴性翻譯途徑發(fā)生。ATF4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)ER體內(nèi)平衡所需的基因轉(zhuǎn)錄。減輕了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生肽鏈折疊的負(fù)荷，但這只是一種臨時性的防御措施。經(jīng)較長時間應(yīng)激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白如GRP78、GRP94、ATF4等表達(dá)增加，提高細(xì)胞處理未折疊蛋白能力。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化eIF2α蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中期應(yīng)激蛋白的表達(dá)和蛋白質(zhì)合成啟動的恢復(fù)也有關(guān)系。PERK的激活也誘導(dǎo)CHOP的產(chǎn)生，是從促存活轉(zhuǎn)為致死信號的重要因素，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3]。

由MCODE算法對ATO相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)拓?fù)潢P(guān)系聚類結(jié)果分析可知，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因在其中占據(jù)較高比重。EIF2AK3、EIF4E、XBP1、ATF6、NFE2L2、 ATF4是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3條通路上的基因，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。第3模塊中的基因全部與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)，提示這些基因可能是關(guān)鍵功能基因群，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞分化向凋亡切換的效應(yīng)機(jī)制。

Fig 6 The differentiation level of HL-60 cells detected by flow cytometry at different concentrations of ATO(±s,n=3)

A: ATO 0 μmol·L-1; B: ATO 1 μmol·L-1; C: ATO 2 μmol·L-1; D: ATO 4 μmol·L-1; E: ATO 8 μmol·L-1; F: Cell differentiation rate; G: CD11b and CD14 fluorescence intensity.**P<0.01vscontrol

A: ATO 0 μmol·L-1; B: ATO 1 μmol·L-1; C: ATO 2 μmol·L-1; D: ATO 4 μmol·L-1; E: ATO 8 μmol·L-1; F: Cell apoptosis rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Chen等[13]發(fā)現(xiàn)ATO作用于NB4細(xì)胞24、72、120 h時，較高濃度(0.5～2 μmol·L-1)先誘導(dǎo)凋亡，低濃度誘導(dǎo)(0.1～0.5 μmol·L-1)部分分化，且PML-RARα蛋白的快速調(diào)節(jié)和降解可能有助于這兩種效應(yīng)。Luesink等[14]研究發(fā)現(xiàn)，1 μmol·L-1的ATO作用于NB4細(xì)胞72 h時，可見Annexin V和PI的雙陽性，同時CD11b表達(dá)略有增加，當(dāng)ATO和ATRA聯(lián)合用藥時，可以觀察到明顯的分化和凋亡雙誘導(dǎo)。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ATO作用于NB4細(xì)胞48 h時，高濃度(1～2 μmol·L-1)通過激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑誘導(dǎo)凋亡，并促進(jìn)低濃度細(xì)胞分化(0.25～0.5 μmol·L-1)。這些研究均證明ATO對APL細(xì)胞確實(shí)具有劑量依賴性雙重作用：在低濃度下誘導(dǎo)分化，在高濃度下引發(fā)細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)部分分化。但這些研究都局限于NB4細(xì)胞，且藥物作用時間較長，未能清楚闡明ATO誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡雙重作用的機(jī)制，以及分化向凋亡切換效應(yīng)所涉及到的基因表達(dá)的改變。

本研究結(jié)果表明，在1～2 μmol·L-1時p-eIF2α蛋白高表達(dá)，而CHOP蛋白表達(dá)低，說明在此濃度下只引起了輕微的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且在該濃度下，細(xì)胞分化事件發(fā)生，特別是在2 μmol·L-1時，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的分群，而凋亡事件并未發(fā)生。在8 μmol·L-1時，p-eIF2α蛋白低表達(dá)，CHOP蛋白高表達(dá)，此時細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，同時分化事件依然存在。在mRNA水平，本文揭示了分化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激事件的時效關(guān)系，由結(jié)果可知，分化發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激事件之后，這說明細(xì)胞分化、凋亡事件的發(fā)生，分化、凋亡切換效應(yīng)均與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激確實(shí)是ATO化療中臨界的一個標(biāo)志，對于毒性預(yù)警和治療極量具有把控價值。更深入的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

(致謝:本研究在石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝在本課題研究中給予幫助和支持的同學(xué)。)

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MechanismofERstressinvolvedinATOinhibitedHL-60proliferation

ZHANG Shan-shan1, LI Tian-yi1, WANG Xiao-qin1, ZHANG Bo1,2

(1.SchoolofPharmaceutics,ShiheziUniversity; 2.KeyLabofXinjiangPlantResourcesandUtilization,MinistryofEducation,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

AimTo explore the pharmacological mechanism of arsenic trioxide(ATO) on endoplasmic reticulum(ER) stress and provide indirect pharmacological indicators for the therapeutic drugs monitoring of acute promyelocytic leukemia.MethodsThe ATO toxicology database was utilized to associate gene data and establish protein-protein interaction networks. MCODE algorithm was used to analyze clustering of network topology relationship in order to find the critical functional gene group. The HL-60 cells were used as the model in this study. The cytotoxicity of ATO to HL-60 was evaluated by MTT assay. Real-time PCR assay was involved in detecting the expression of stress-related genes in ER stress. Western blot was used to detect the expression of stress-related proteins in ER stress. ER-specific staining was conducted by ER-Tracker Red. Cell differentiation and apoptosis was tested by flow cytometry.Results206 ATO-related genes had 3 794 pairs of relationships, and ER stress-related module was outstanding among the top 4 gene cluster. ATO inhibited HL-60 cell proliferation in a dose-dependent manner; 4 h after administration ATO could induce ER stress. The expressions of GRP78 and GRP94 were significant and the gene expression level changed greatly over time. The expression level of GRP78, GRP94 and Nrf2 was induced by 1～4 μmol·L-1ATO, and the expression of CHOP was significant by 8 μmol·L-1ATO. ATO could induce the phosphorylation level of eIF2α protein at 1～2 μmol·L-1as well as a large expression of CHOP protein markedly at 8 μmol·L-1. As shown in ER-specific staining, ATO at 4, 8 μmol·L-1induced ER swelling. Flow cytometry showed that ATO could induce cell differentiation at 1 μmol·L-1, and the differentiation group was obvious at 2 μmol·L-1. So as to the concentration of 4 and 8 μmol·L-1, but the apoptotic group emerged at 8 μmol·L-1.ConclusionATO can inhibit the proliferation of HL-60 and in this process, ER stress is involved, which shows a concentration-dependent phase-switching effect.

acute promyelocytic leukemia; arsenic trioxide; ER stress; differentiation; apoptosis; MCODE algorithm

A

1001-1978(2017)11-1589-07

R329.24；R733.710.22；R979.1

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.044.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.022

2017-07-18,

2017-08-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81460566，U1603122)

張閃閃(1992-)，女，碩士生，研究方向：系統(tǒng)藥理學(xué)與分子藥理學(xué)，E-mail：1520813826@qq.com； 張 波(1978-)，男，博士，教授，研究方向：系統(tǒng)藥理學(xué)與中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：bozhang_lzu@126.com