鄭曉佳，余 婷，張 華，李春鳳，陳葉霞，陽勇珍，李晨昕，簡 潔

(桂林醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院、2.附屬醫(yī)院感控科，廣西 桂林 541004)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的抑制作用及其機(jī)制

鄭曉佳1，余 婷1，張 華1，李春鳳2，陳葉霞1，陽勇珍1，李晨昕1，簡 潔1

(桂林醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院、2.附屬醫(yī)院感控科，廣西 桂林 541004)

目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)對H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的抑制作用及其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為正常(N)、缺氧/復(fù)氧(H/R)、EGCG低劑量(L)、中劑量(M)和高劑量組(H)，共5組(n=6)。建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，給予EGCG預(yù)處理，用CCK-8 法測定細(xì)胞存活率；Annex V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率；按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)液T-AOC、TNF-α含量；用Western blot 法檢測Akt蛋白及磷酸化水平；用熒光定量PCR法檢測PI3K、Akt、caspase-3基因表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，EGCG能增加H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的存活率，減少細(xì)胞凋亡，提高T-AOC水平，降低TNF-α含量，增加PI3K、Akt和p-Akt表達(dá)，減少caspase-3的表達(dá)。結(jié)論EGCG通過影響PI3K/Akt信號通路，減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。

EGCG；H9c2心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧損傷；細(xì)胞凋亡；PI3K/Akt；caspase-3

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)為綠茶中的抗氧化活性成分[1]，具有清除氧自由基、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。有文獻(xiàn)報道[2]，EGCG為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，可逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥。近期研究發(fā)現(xiàn)[3]，EGCG可通過激活PI3K/Akt通路來減少心臟、腎臟、腸等缺血/再灌注損傷，但是EGCG的上述研究大多是體內(nèi)研究，體外研究少有報道。因此，本實驗以大鼠H9c2心肌細(xì)胞為研究對象，探討EGCG對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的抑制作用及機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞株與分組H9c2心肌細(xì)胞株，購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)融合至80%～90%后，將培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常對照組(Normal組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R組)、EGCG 12 mg·L-1組(L組)、EGCG 18 mg·L-1組(M組)、EGCG 24 mg·L-1組(H組)。

1.2藥物EGCG購自美國Sigma公司，批號：E4 143，純度≥95%。

1.3試劑與儀器DMEM培養(yǎng)液(Gibco，貨號：116467)；特級胎牛血清(四季青，貨號11011-8611)；CCK-8試劑盒(日本同仁，批號：CK04)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(廣州BD生物科技有限公司，批號：35562)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)試劑盒(達(dá)科維公司，批號：E3720-1207-2)；總抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：A015)；Akt和p-Akt抗體(CST公司，批號：4685和4060)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，批號：CKD8025032)。CO2孵箱(日本SANYO公司，型號：MCO-15AC)；酶聯(lián)免疫檢測儀(瑞士TECAN公司，型號：Infinite M200 PRO)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司，型號：Accuri C6)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司，型號：ChemiDocTMXRS+)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司，型號：CFX96TMReal-Time System)等。

2 方法

2.1模型建立預(yù)先用高純氮氣(999 mL·L-1)飽和無糖DMEM液，通氣持續(xù)時間≥40 min, 即為低氧液；用高純氧(999 mL·L-1)飽和高糖DMEM液，通氣持續(xù)時間≥40 min，即為復(fù)氧液。細(xì)胞培養(yǎng)融合至80%～90%后，用低氧液置換正常培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)板置于密封保鮮袋中，充入高純氮氣造成缺氧培養(yǎng)環(huán)境, 封口培養(yǎng)4 h；4 h后，以復(fù)氧液置換低氧液，排出氮氣并充以高純氧，繼續(xù)培養(yǎng)4 h即為心肌細(xì)胞復(fù)氧。除Normal組和H/R組外，各組細(xì)胞均于造模前4 h加入相應(yīng)藥物預(yù)處理。

2.2測定指標(biāo)

2.2.1CCK-8法測定細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約5 000個，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(37℃，95%空氣+5% CO2)，待細(xì)胞融合至80%～90%后進(jìn)行處理。每個實驗組的處理按照上述對應(yīng)建模方法，每組設(shè)6個復(fù)孔。細(xì)胞處理結(jié)束后，按CCK-8試劑盒說明書操作，重復(fù)測定3次。

2.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按不同的實驗要求處理細(xì)胞后，按照凋亡試劑盒說明書操作，并用 Flowjo 7.6軟件處理分析，計算細(xì)胞凋亡率。

2.2.3細(xì)胞培養(yǎng)液T-AOC、TNF-α含量測定 按不同的實驗要求處理細(xì)胞后，按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中T-AOC及TNF-α的含量。

2.2.4Western blot法檢測p-Akt及Akt蛋白表達(dá) 按不同的實驗要求處理細(xì)胞后，用蛋白提取試劑盒按操作說明提取細(xì)胞總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜上，5% BSA封閉2 h，用TBST清洗3次，分別加入p-Akt、Akt 抗體(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST 清洗3次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，ECL顯色。將PVDF膜放入凝膠掃描系統(tǒng)曝光及圖片掃描成像。采用ImageJ軟件計算分析各蛋白條帶和對應(yīng)的內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶的灰度。

2.2.5qRT-PCR法檢測PI3K、Akt、caspase-3基因表達(dá) 細(xì)胞造模結(jié)束后，使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，使RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光實時定量PCR為20 μL反應(yīng)體系：power SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 5 μL，雙蒸水3 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個循環(huán)。根據(jù)比較法計算基因表達(dá)相對量。采用公式2-ΔΔCt計算基因表達(dá)的相對倍數(shù)變化。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers of detected genes

3 結(jié)果

3.1EGCG對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后存活率的影響如Fig 1所示，H/R組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；EGCG預(yù)處理可以增加H/R損傷細(xì)胞的存活率，且EGCG濃度為18 mg·L-1時效果最好(P<0.05)。

Fig 1 Effect of EGCG on survival rate of H9c2cardiac myocytes exposed to hypoxia/reoxygenation

*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH/R group

3.2EGCG對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞凋亡的影響Fig 2結(jié)果顯示，正常組心肌細(xì)胞凋亡不明顯(凋亡率<5%)，H/R后心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；3個劑量的EGCG均能減少心肌細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)，且中劑量組效果最明顯。

Fig 2 Effect of EGCG on apoptotic rate of H9c2cardiac myocytes exposed to hypoxia/reoxygenation

*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH/R group

3.3EGCG對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞培養(yǎng)上清液T-AOC及TNF-α含量的影響由Tab 2可見，H/R組心肌細(xì)胞上清液T-AOC明顯降低，且TNF-α含量明顯增高(P<0.05)；給藥組3個劑量均能增加T-AOC，減少TNF-α(P<0.05)，其中中劑量組效果最明顯。

3.4EGCG對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常組相比，H/R組p-Akt/Akt的水平明顯降低(P<0.01)；與H/R組相比，給藥組3個劑量均能增加p-Akt/Akt 的水平(P<0.05)，中劑量組p-Akt/Akt水平增加最明顯。

Tab 2 Effects of EGCG on contents ofT-AOC and TNF-α of H9c2 cardiac myocytes exposed tohypoxia/reoxygenation(±s，n=8)

*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH/R group

Fig 3 Effect of EGCG on expression of p-Akt/Akt of H9c2cardiac myocytes exposed to hypoxia/reoxygenation

**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group

3.5EGCG對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后PI3K、Akt、caspase-3基因表達(dá)的影響如Fig 4所示，與正常組相比，H/R組PI3K、Akt的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；給藥組均能增加PI3K、Akt 的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，其中中劑量EGCG組增加最明顯。H/R時，caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；給藥組均能降低caspase-3的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，其中中劑量減少最明顯。

4 討論

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)指在短時間內(nèi)中斷心肌血供，且在短時間內(nèi)恢復(fù)血供。較血供恢復(fù)前，原缺血心肌在代謝、結(jié)構(gòu)、功能等方面發(fā)生更嚴(yán)重甚至不可逆損傷，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種生物活性分子和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，例如活性氧、鈣超載、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道的開放等[4]。

Fig 4 Effect of EGCG on mRNA levelsof PI3K, Akt and caspase-3 of H9c2 cardiac myocytesexposed to hypoxia/reoxygenation

*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH/R group

在MIRI發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多以及心肌抗氧化能力降低[5]。抗氧化能力對機(jī)體防御反應(yīng)至關(guān)重要，總抗氧化能力的強(qiáng)弱直接影響心肌細(xì)胞的生存狀態(tài)。因此，總抗氧化力的強(qiáng)弱可反映心肌細(xì)胞受損傷的程度。本實驗中模型組心肌細(xì)胞T-AOC明顯降低，而EGCG預(yù)處理則可增強(qiáng)T-AOC，提高心肌細(xì)胞的存活率。文獻(xiàn)報道[6]，EGCG在低濃度時對細(xì)胞沒有損傷，但在高濃度時會抑制細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果表明，中劑量(18 mg·L-1)EGCG預(yù)處理效果最好，EGCG抑制心肌細(xì)胞損傷的最佳濃度還有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致MIRI的一個重要因素，主要包括死亡受體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3種凋亡途徑[7]。死亡受體途徑又稱外源性凋亡途徑，由細(xì)胞外信號導(dǎo)致。死亡受體是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族中的一個亞家族[8]，TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ為腫瘤壞死因子受體家族中的兩個受體亞型，可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。TNFR-Ⅰ三聚體化后，同死亡區(qū)的腫瘤壞死因子受體1相關(guān)蛋白抗原銜接，進(jìn)一步與Fas相關(guān)死亡域蛋白結(jié)合，激活caspase途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生；TNFR-Ⅱ被激活，隨后激活NF-κB，NF-κB的抑制能夠減少炎癥因子TNF-α的釋放，減少細(xì)胞凋亡[10]。本實驗結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α的含量很低，而模型組的TNF-α含量明顯上升，H/R損傷后有大量的細(xì)胞凋亡，EGCG預(yù)處理組可明顯降低TNF-α含量，降低心肌細(xì)胞凋亡率。提示EGCG減少H/R損傷心肌細(xì)胞凋亡可能是通過外源性凋亡途徑，減少TNF-α的釋放而發(fā)揮作用。

線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的另一條重要途徑，又稱為內(nèi)源性凋亡途徑。細(xì)胞色素C(cytC)在ATP/dATP存在的情況下，與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)形成多聚復(fù)合體，活化caspase-9，進(jìn)一步活化caspase-3[11]。Caspase-3是caspases 家族中重要的凋亡執(zhí)行者之一，是激活各種凋亡刺激因子的關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用[12]。本研究結(jié)果顯示，EGCG減少caspase-3基因表達(dá)，提示EGCG可能通過內(nèi)源性凋亡途徑抗細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號通路是一條重要的抗凋亡/促增殖信號途徑。心肌缺血/再灌注時，激活PI3K/Akt通路，Akt 在Ser473位點磷酸化變成p-Akt，作用于多個下游靶點，通過調(diào)控凋亡蛋白如caspase 家族、控制代謝等多種方式促進(jìn)抗凋亡機(jī)制的活化，增加細(xì)胞存活，降低MIRI的發(fā)病率及死亡率。大量文獻(xiàn)表明，激活PI3K/Akt信號通路在抗凋亡過程中起關(guān)鍵作用[13]。課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，EGCG通過影響PI3K/Akt信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，減少再灌注期過度自噬，對MIRI大鼠起保護(hù)作用[14]。本實驗結(jié)果亦顯示，H/R組中PI3K mRNA表達(dá)以及p-Akt蛋白表達(dá)明顯減少，給藥組增加PI3K及p-Akt的表達(dá)。EGCG干預(yù)可通過影響PI3K/Akt信號通路、外源性及內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑，減少心肌細(xì)胞凋亡，對心肌細(xì)胞H/R損傷產(chǎn)生抑制作用，具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步的實驗驗證。

綜上所述，EGCG預(yù)處理可提高心肌細(xì)胞總抗氧化力，減少TNF-α釋放和caspase-3蛋白的表達(dá)，影響PI3K/Akt信號通路，減少心肌細(xì)胞凋亡，提高心肌細(xì)胞H/R損傷的存活率，保護(hù)心肌細(xì)胞。

(致謝：本實驗在桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心及藥理實驗室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)

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Protectiveeffectofepigallocatechin-3-gallateonhypoxia/reoxygenationinjuryincardiacmyocytesanditsmechanism

ZHENG Xiao-jia1,YU Ting1,ZHANG Hua1,LI Chun-feng2, CHEN Ye-xia1,YANG Yong-zhen1,LI Chen-xin1, JIAN Jie1

(1.CollegeofPharmacy,GuilinMedicalUniversity;2.DeptofInfectionControl,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541004)

AimTo observe the protective effect of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)on hypoxia/reoxygenation (H/R) injury of cardiac myocytes and its mechanisms.MethodsH9c2 cardiac myocytes were culturedinvitroand randomly divided into five groups: normal group(N group), H/R group, EGCG low dose group (L group), EGCG medium dose group (M group), and EGCG high dose group(H group). The cardiomyocyte H/R injury model was established and EGCG was pretreated. Cell survival rate was tested by CCK-8 method. The cell apoptotic rate was detected using Annexin V-FITC/PI double staining. The contents of total antioxidant capacity(T-AOC) and tumor necrosis factor α(TNF-α) in cell culture medium were tested according to the kit instructions. The protein expression of Akt and p-Akt was observed using Western blot, while the gene expressions of PI3K, Akt, caspase-3 were detected by using fluorescence quantitative PCR method.ResultsCompared with model group, EGCG increased cell survival rate and reduced the apoptosis after H/R injury. Meanwhile, pretreatment EGCG improved the activity of T-AOC, reduced the level of TNF-α, up-regulated the expression of PI3K, Akt and p-Akt, and down-regulated the expression of caspase-3.ConclusionEGCG reduces apoptosis and protects cardiac myocytes by influencing PI3K/Akt signal pathway.

EGCG; H9c2 cardiac myocytes; hypoxia/reoxygenation injury; cell apoptosis；PI3K/Akt; caspase-3

A

1001-1978(2017)11-1584-05

R-332；R282.71；R329.25；R329.411；R845.22；R977.6

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.042.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.021

2017-06-22,

2017-07-24

廣西高校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目(No 201510601007)；廣西高等學(xué)校優(yōu)秀人才資助計劃項目

鄭曉佳(1992-)，女，碩士生，研究方向：心肌缺血損傷修復(fù)，E-mail：237452044@qq.com； 余 婷(1995-)，女，研究方向：心肌缺血損傷修復(fù)，共同第一作者，E-mail：1010492130@qq.com； 簡 潔(1972-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心肌缺血損傷修復(fù)，通訊作者，E-mail：jianjielucky@aliyun.com