朱燕飛，陳全家，曲延英

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

利用mRNA差異顯示技術(shù)篩選線果芥抗旱相關(guān)基因

朱燕飛，陳全家，曲延英

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

目的十字花科短命植物線果芥在新疆干旱環(huán)境下生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抗旱性，研究十字花科短命植物線果芥的抗旱機(jī)制。為進(jìn)一步了解線果芥的抗旱機(jī)理和從野生植物資源中發(fā)掘一些優(yōu)異的抗逆基因奠定基礎(chǔ)。方法用20% PEG6000處理3～4周的線果芥幼苗，分別提取0、3、6、9、12、24及48 h的線果芥葉片總RNA。用mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)的基因。結(jié)果使用80對(duì)引物組合共篩選獲得差異片段18個(gè)，分別命名為DF1-DF18，其中表達(dá)上調(diào)的有12個(gè)，下調(diào)的有6個(gè)。按照基因的功能可以劃分為6大類(lèi)：基礎(chǔ)代謝、轉(zhuǎn)錄因子、抗病相關(guān)、假想蛋白、未知蛋白和光周期蛋白。其中以基礎(chǔ)代謝相關(guān)基因最多。對(duì)其中的DF-2、DF-6及DF-14進(jìn)行高鹽和干旱脅迫下的表達(dá)模式分析，這三個(gè)基因均受干旱和鹽調(diào)控表達(dá)。結(jié)論從短命植物線果芥中篩選了18個(gè)抗旱相關(guān)的基因，并對(duì)其中的3個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，的確受干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。

線果芥；抗旱；mRNA差異顯示

0 引 言

【研究意義】 干旱嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量，近年來(lái)，全球每年因干旱引起的糧食減產(chǎn)越來(lái)越頻繁。如何讓農(nóng)作物免受或者減輕受災(zāi)程度，是人類(lèi)亟待解決的問(wèn)題。篩選抗旱關(guān)鍵基因并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，增強(qiáng)作物的抗旱性，是解決此問(wèn)題的一條有效途徑。【前人研究進(jìn)展】 線果芥屬于十字花科線果芥屬，是早春短命植物。線果芥屬有8種，產(chǎn)中歐，地中海地區(qū)，中亞；我國(guó)有1種，產(chǎn)新疆、西藏。線果芥(C.planisiliquaFisch.et.Mey.)，為十字花科類(lèi)草本植物。高30～60 cm，下部被單毛，上部無(wú)毛。莖直立，不分枝。種子淡黑褐色，短圓形，長(zhǎng)約1.5 mm，除種臍端外，有窄邊，種臍色重；子葉緣倚胚根?；ㄆ?～6月。生長(zhǎng)在低山帶礫石的山坡及干河床等地方，海拔900～1 000 m。目前對(duì)短命植物的研究主要集中在種群分類(lèi)[1,2]，繁殖生態(tài)[3,4]，光合效率[5]，種子生物學(xué)[6]等方面。線果芥在Schulz(1936)系統(tǒng)中歸屬于蕓苔族，孫稚穎等[7]發(fā)現(xiàn)線果芥的染色體基數(shù)為7，形態(tài)特征和舟果芥屬和菘藍(lán)屬相近。趙博[8]利用DNA序列研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)線果芥與厚壁芥，舟果芥和菘藍(lán)的親緣關(guān)系較近，應(yīng)該歸于菘藍(lán)。對(duì)于其內(nèi)在基因資源挖掘方面比較少。近幾年才開(kāi)始對(duì)其相關(guān)抗逆基因進(jìn)行克隆。許春華[9]對(duì)線果芥等在內(nèi)的六種短命植物進(jìn)行PEG6000模擬干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，線果芥具有較強(qiáng)的抗旱性。陳琴[10,11]利用同源基因克隆技術(shù)克隆了線果芥的CpHRD轉(zhuǎn)錄因子基因，并轉(zhuǎn)化了煙草。對(duì)相關(guān)抗旱生理指標(biāo)的鑒定發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)CpHRD基因煙草的抗旱性顯著提高。自從Liang 等(Liang and Pardee,1992)[12]發(fā)明了 DDRT—PCR 技術(shù)后，該技術(shù)由于具有快速、簡(jiǎn)單、所需RNA量少，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于分離克隆真核生物差異表達(dá)的基因。 該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)各個(gè)領(lǐng)域，如農(nóng)業(yè)、植物[13-14]、動(dòng)物[15]、醫(yī)學(xué)[16]、菌類(lèi)等，涉及基因誘導(dǎo)表達(dá)、雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理、植物抗逆性、發(fā)育分子機(jī)理、基因克隆等方面的研究，已成功分離到數(shù)百種基因。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)線果芥抗旱基因的分離和利用方面的報(bào)道很少。為充分發(fā)掘和利用其抗旱基因資源，需要從分子水平上對(duì)其抗旱機(jī)理進(jìn)行研究。研究利用mRNA差異顯示技術(shù)篩選線果芥抗旱相關(guān)基因?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究采用mRNA差異顯示技術(shù)對(duì)不同處理?xiàng)l件下的線果芥差異表達(dá)基因進(jìn)行分離，回收，二次PCR后測(cè)序，同源性比對(duì)分析等，發(fā)掘其中的耐旱基因核心片段，為進(jìn)一步克隆線果芥中全長(zhǎng)的抗旱基因和作物抗逆育種提供一定的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材 料

線果芥種子來(lái)源于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物教研室，實(shí)驗(yàn)室種植收獲的種子。

RevertAidTMFirstStrand cDNA SynthesisKit購(gòu)自Thermo Scientific公司，TRNzol Reagent ,PCR試劑,普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,Marker2000都購(gòu)自天根。引物合成及測(cè)序均由北京華大基因完成。

1.2方法

1.2.1處理

將線果芥種子播種于蛭石∶珍珠巖∶土為1∶2∶3的土壤中，在溫度為25/23℃，光照為4 000 lx的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)到3～4周時(shí)，即有5～8片真葉時(shí)，用20%的PEG6000澆灌，進(jìn)行模擬干旱脅迫處理、NaCl模擬鹽脅迫處理，分別采集脅迫0、3、6、9、12和24 h的線果芥幼苗葉片。用液氮速凍后，置于-70℃的冰箱中保存。

1.2.2 總RNA提取與純化

用天根的Trizol植物提取試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用DNaseⅠ試劑盒去除RNA中的DNA。然后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的質(zhì)量。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄及mRNA差異顯示

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取2 μg RNA,用四條錨定引物，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈。表1

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍后，取2 μL模板cDNA，80對(duì)PCR 擴(kuò)增引物由 4條錨定引物和20條隨機(jī)引物組合而成。反應(yīng)體系20 μL包括:10×ExTaqBuffer ( Mg2+plus ) 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 mmol/L錨定引物1 μL，10 mmol/L隨機(jī)引物 1 μL，2.5 U/μL ExTaq酶0.25 μL， ddH2O 12.75 μL。擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性 5 min; 94℃變性 30 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 1.25 min，35個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。采用 6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，顯色后拍照并記錄。表2

1.2.4 差異片段回收純化、克隆測(cè)序

采用煮沸法回收差異片段[17]，回收的差異片段用 10 μL 雙蒸水溶解，取 4 μL 作為模板以相同的擴(kuò)增條件和引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳分離，采用天根的瓊脂糖凝膠試劑盒回收 DNA 條帶，與 pMD19-T載體 16℃ 過(guò)夜連接，而后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài) DH5α中，使用氨芐青霉素對(duì)含有重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行篩選和搖菌培養(yǎng)，然后使用基因?qū)?yīng)的擴(kuò)增引物或者 M13 + /-引物進(jìn)行菌液 PCR 檢驗(yàn)陽(yáng)性重組子。對(duì)陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

表1 mRNA差異顯示錨定引物
Table 1 The anchor primers sequences for mRNA differetial display

引物名稱Primername引物序列5’-3’Sequence5’-3’M1ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTVAM2ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTVCM3ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTVGM4ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTVT

表2 mRNA 差異顯示隨機(jī)引物
Table 2 The random primers sequences for mRNA differetial display

引物名稱Primername引物序列5’-3’Sequence5’-3’R1ACAATTTCACACAGGACGACTCCAAGR2ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATGGR3ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATGGR4ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGACR5ACAATTTCACACAGGAATGGTAGTCTR6ACAATTTCACACAGGAATGGTAGTCTR7ACAATTTCACACAGGATGGATTGGTCR8ACAATTTCACACAGGATGGTAAAGGGR9ACAATTTCACACAGGATAAGACTAGCR10ACAATTTCACACAGGAGATCTCAGACR11ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTGTR12ACAATTTCACACAGGAGGTACTAAGGR13ACAATTTCACACAGGAGTTGCACCATR14ACAATTTCACACAGGATCCATGACTCR15ACAATTTCACACAGGACTTTCTACCCR16ACAATTTCACACAGGATCGGTCATAGR17ACAATTTCACACAGGACTGCTAGGTAR18ACAATTTCACACAGGATGATGCTACCR19ACAATTTCACACAGGATTTTGGCTCCR20ACAATTTCACACAGGATCGATACAGG

1.2.5 差異片段的同源性

利用DNAman軟件(version 5.2；Lynnon Biosoft)去除載體序列；然后用 NCBI 網(wǎng)站上 Blast n軟件對(duì)差異片段進(jìn)行同源性比對(duì)分析。利用最相近的序列進(jìn)行生物學(xué)功能注釋。

1.2.6 干旱和鹽處理下DF-2、DF-6、DF-14的基因表達(dá)

使用7 500 Fast Real-Time PCR System,用SYBR Green Ⅰ熒光染料法檢測(cè)線果芥幼苗在20% PEG6000和200 Mm NaCl處理下不同時(shí)間段的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

反應(yīng)體系參照Fast SYBR Green Master Mix ABI Applied Biosystems試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。引物如下：DF-2-F:TACATACTTCACCACCACATAATCC,DF-2-R:GGTCAAGAATGGTCAGAAAGG;DF-6-F:GCAATCATCAGGCATCCACG,DF-6-R:TGACATTCCACCCGAAACAA;DF-14-F:TGCTTTCGCTGGTGTTATCT,DF-14-R:GGAAGCTGTGGAGGAAACTAC.Actin-F:TGACGGAGAATTAGGGTTCGA,Actin-R:CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT.反應(yīng)體系中含有10 μL Fast SYBR Green Master Mix(2×),引物各0.4 μL，稀釋的cDNA模板2 μL，滅菌水7.2 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃酶的激活20 s，95℃變性3 s，60℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

反應(yīng)結(jié)束后做溶解曲線以及利用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。結(jié)果繪制成柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取

RNA電泳檢測(cè)結(jié)果，28S和18S兩條帶的亮度呈現(xiàn)出 2∶1 的比例; 紫外分光光度計(jì)檢測(cè) OD260/ OD280值在 1.9～2.0，說(shuō)明 RNA質(zhì)量較高，適用于后續(xù)分析。圖1

2.2 差異顯示

研究表明，在80個(gè)引物組合中，錨定引物 Oligo( dT)M2組成的引物對(duì)擴(kuò)增出的差異條帶最多，效果最好。挑選表達(dá)量增加或者減少的條帶回收，測(cè)序，得到18條重復(fù)性較好的差異條帶。條帶大小基本為150～300 bp，其中有兩條為414和559 bp的條帶。所得條帶平均長(zhǎng)度為231 bp， 二次擴(kuò)增特異性較好的片段有18條，其中克隆測(cè)序的有18條。圖2

2.3 功能分類(lèi)

二次回收測(cè)序的18個(gè)條帶經(jīng)過(guò)NCBI序列相似性比對(duì)，可以分為以下幾類(lèi)：(1)假想蛋白相關(guān)片段3個(gè)，蕓薹屬的白菜型甘藍(lán)的假定抗病蛋白DF-1，山萮菜假想蛋白DF-3、DF-4。(2)基礎(chǔ)代謝相關(guān)片段7個(gè)，亞麻薺的富含半胱氨酸的類(lèi)受體蛋白激酶37 ，DF-5，白菜型甘藍(lán)維管束蛋白DF-6，白菜型油菜葉綠體類(lèi)囊體蛋白曲率1A ，DF-7。擬南芥氨基酸通透酶1 mRNA， DF-8，甘藍(lán)型白菜的氨基酸通透酶1 ，DF-9。擬南芥肽酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶CYP63-like家族蛋白mRNA， DF-16，甘藍(lán)型油菜富含谷氨酸細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白1，DF-12。(3)抗病相關(guān)蛋白3個(gè)，蘿卜的腈特異蛋白5，DF-2,擬南芥AMC7，DF-10和甘藍(lán)型油菜MLO-like protein 12，DF-11。(4)未知蛋白2個(gè)，DF-17和DF-18。(5)光周期相關(guān)2個(gè)，擬南芥光周期相關(guān)的蛋白CCA1，DF-13。亞麻薺假定GATA轉(zhuǎn)錄因子13，DF-15，在擬南芥中假定的GATA轉(zhuǎn)錄因子13有可能對(duì)光響應(yīng)基因具有調(diào)控作用。(6)轉(zhuǎn)錄因子1個(gè)，擬南芥alfin-like 1蛋白相似的片段DF-14。表3，圖3

圖1 線果芥總RNA 電泳圖
Fig.1 Total RNA electrophoresis of C．planisiliqua

Note: 1:ck 2:3 h 3:6 h 4:9 h 5:12h 6:24 h 7:48 h

圖2 部分cDNA 差異條帶的6%PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 Partical cDNA differential bands dected on 6% denaturing polyacrylamide-urea gel

表3 DFs 序列與 NCBI 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的 BLAST 序列比對(duì)

Table 3 Similarity of DFs to known genes by BLAST search against NCBI nucleotide database

序列名稱Sequencename長(zhǎng)度Length(bp)功能注釋Annotation最匹配登錄號(hào)Bestmatchaccessionno．E值E-valueDF-1200蕓薹屬的白菜型甘藍(lán)的假定抗病蛋白Brassicarapasubsp．pekinensiscra4geneforputativediseaseresistanceproteinAB75152016e-27DF-2414蘿卜的腈特異蛋白5PREDICTED：Raphanussativusnitrile-specifierprotein5-likeXM＿01861160411e-64DF-3266山崳菜假想蛋白EutremasalsugineumhypotheticalproteinXM＿00640767311e-42DF-4173山崳菜假想蛋白EutremasalsugineumhypotheticalproteinXM＿00639145817e-48DF-5110亞麻薺的富含半胱氨酸的類(lèi)受體蛋白激酶37Camelinasativacysteine-richreceptor-likeproteinkinase37XM＿01043445315e-27DF-6559甘藍(lán)型白菜維管束蛋白BrassicanapusproteinCONTINUOUSVASCULARRING1XM＿01379768111e-170DF-7279白菜型油菜葉綠體類(lèi)囊體蛋白曲率1ABrassicarapaproteinCURVATURETHYLAKOID1A，chloroplasticXM＿00913626815e-66DF-8238擬南芥氨基酸通透酶1mRNAArabidopsisthalianaaminoacidpermease1mRNANM＿10461643e-52DF-9217甘藍(lán)型白菜的氨基酸通透酶1Brassicarapaaminoacidpermease1-likeX1150691M＿0091e-60DF-10199擬南芥metacaspase7Arabidopsisthalianametacaspase7(AMC7)mRNAAY322252922e-52DF-11165甘藍(lán)型油菜MLO-likeprotein12BrassicanapusMLO-likeprotein12XM＿01387916014e-28DF-12209甘藍(lán)型油菜富含谷氨酸細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白1Brassicarapaglycine-richcellwallstructuralprotein1-like，mRNAXM＿00912074524e-05DF-13118擬南芥CCA1蛋白的mRNAArabidopsisthalianaproteinCCA1mRNANM＿18012934e-13DF-14187擬南芥alfin-like1蛋白的mRNAArabidopsisthalianaalfin-like1proteinmRNANM＿18044424e-60DF-15138亞麻薺假定GATA轉(zhuǎn)錄因子13CamelinasativaputativeGATAtranscriptionfactor13XM＿01041624117e-07DF-16212擬南芥肽酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶CYP63-like家族蛋白mRNABrassicanapuspeptidyl-prolylcis-transisomeraseCYP63-likeXM＿01388636411e-51DF-17167亞麻薺未知特性蛋白ycf39-likeCamelinasativauncharacterizedproteinycf39-likeXM＿01044865818e-32DF-18262甘藍(lán)型油菜未知蛋白BrassicanapusuncharacterizedXM＿01382759012e-80

圖3 功能分類(lèi)及所占比例

Fig.3 Functional classification and proportion

2.4 部分基因在干旱和鹽脅迫下的表達(dá)

研究表明，在PEG6000脅迫處理下，DF-2、DF-14隨著時(shí)間，動(dòng)態(tài)上調(diào)表達(dá)，DF-2在9 h表達(dá)量達(dá)到相對(duì)最高值，DF-14在6 h表達(dá)量相對(duì)最高。DF-6表達(dá)受PEG6000下調(diào)。

在鹽脅迫下，DF-2和DF-14隨著時(shí)間都是動(dòng)態(tài)上調(diào)表達(dá)，都在24 h表達(dá)量相對(duì)最高，DF-6在3 h表達(dá)量最高，隨后就低于對(duì)照。說(shuō)明DF-2、DF-14對(duì)鹽的脅迫響應(yīng)速度要比DF-6的速度慢。說(shuō)明DF-2、DF-6、DF-14的表達(dá)的確是受干旱和鹽誘導(dǎo)表達(dá)的。圖4

圖4 DF-2、DF-6、DF-14的熒光定量表達(dá)
Fig.4 The expression of DF-2、DF-6、DF-14 under different treatments dected by qRT-PCR

3 討 論

線果芥為新疆特有的短命植物，長(zhǎng)期生活在干旱的沙漠，礫石邊緣。長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，適應(yīng)了干旱的生活環(huán)境。對(duì)其自身的抗逆機(jī)理尚缺乏認(rèn)識(shí)。利用mRNA差異顯示技術(shù)對(duì)其抗旱基因的篩選。

從所篩的基因可以看出，基因的片段普遍偏小，對(duì)于基因的下一步研究，有一定的困難，要挑選功能未知，長(zhǎng)一點(diǎn)的片段進(jìn)行下一步研究。錨定引物 Oligo(dT)M2的隨機(jī)組合所得到的差異條帶最多。從所篩選的30個(gè)條帶中二次回收，克隆測(cè)序的為18條，陽(yáng)性率為60%。

從發(fā)現(xiàn)的基因分類(lèi)來(lái)說(shuō)，基礎(chǔ)代謝所占的比例最高，有38.89%,其次是假想蛋白和抗病蛋白所占比例都為16.67%, 未知蛋白與光周期蛋白所占比例相同，都為11.11%,轉(zhuǎn)錄因子所占比例最小，為5.56%。從這一結(jié)果也說(shuō)明植物在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)，有相關(guān)蛋白激酶，維管束蛋白，光合作用，氨基酸通透酶，順?lè)串悩?gòu)酶，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，轉(zhuǎn)錄因子的參與。但是光周期和抗病相關(guān)蛋白也有響應(yīng)，這個(gè)較少發(fā)現(xiàn)。植物的抗逆性機(jī)理是交叉脅迫的，有些基因可以參與植物的生物脅迫及非生物脅迫。其中基礎(chǔ)代謝相關(guān)的基因研究的比較多，因此抗病蛋白，假想蛋白，未知蛋白及轉(zhuǎn)錄因子具有進(jìn)一步的研究意義。

富含半胱氨酸的類(lèi)受體激酶(cysteine-rich receptor-like kinase，CRK) 又被稱為 DUF26(domain of unknown function 26) 類(lèi)受體激酶， 是類(lèi)受體激酶(receptor-like kinase，RLK) 中的一大類(lèi)。RLK是植物體中許多信號(hào)識(shí)別傳遞途徑中的關(guān)鍵質(zhì)膜受體。通過(guò)磷酸化作用參與胞內(nèi)信號(hào)傳遞。近幾年研究發(fā)現(xiàn) CRK 參與了植物的抗病及抗逆反應(yīng)。張秀娟[18]發(fā)現(xiàn)擬南芥的CRK45 通過(guò)調(diào)節(jié) ABA 的生物合成而調(diào)控著擬南芥對(duì)非生物脅迫如干旱、高鹽以及 ABA 的響應(yīng)；同時(shí)，CRK45 也參與了擬南芥對(duì)生物脅迫的應(yīng)答，在依賴水楊酸的抗病信號(hào)途徑中，CRK45 位于 NPR1 的下游，在轉(zhuǎn)錄水平上受到轉(zhuǎn)錄因子 NPR1 和 WRKY70 的調(diào)控。擬南芥的AtCRK36 受非生物脅迫的誘導(dǎo)[19]，在細(xì)胞內(nèi)AtCRK36 與AtCRK45 在質(zhì)膜結(jié)合，體外實(shí)驗(yàn)中，AtCRK36 可 使AtCRK45磷酸化，進(jìn)而引發(fā)下游逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。因此，AtCRK45 與AtCRK36 在植物細(xì)胞內(nèi)共同作用，并參與應(yīng)答 ABA 和滲透脅迫信號(hào)的負(fù)調(diào)控反應(yīng)[20-21]。實(shí)驗(yàn)篩選得到的DF-5片段在植物響應(yīng)干旱脅迫中表達(dá)，說(shuō)明在線果芥響應(yīng)干旱脅迫中起作用。

Alfin-like 轉(zhuǎn)錄因子屬于植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD結(jié)構(gòu)域)轉(zhuǎn)錄因子家族。擬南芥Alfin-like 家族共有7個(gè)Alfin-like 基因。

對(duì)于Alfinlike轉(zhuǎn)錄因子的功能研究比較少，最早發(fā)現(xiàn)其在抗逆方面的功能是從苜蓿的差顯中發(fā)現(xiàn)Alfin轉(zhuǎn)錄因子能夠提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽能力[22-23]。其次在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，AL6在植物響應(yīng)低磷脅迫時(shí)有助于植物根毛的生長(zhǎng)[24]。AL6和AL7共同作用，也會(huì)影響擬南芥種子在滲透脅迫和鹽脅迫下種子的發(fā)芽率[25]。AL7在植物耐鹽脅迫中起負(fù)調(diào)控作用，在鹽脅迫下，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的根變短，al7突變體的根反而伸長(zhǎng)[26]。AL5過(guò)表達(dá)株系顯著提高了植物的抗旱，耐鹽和耐冷脅迫能力。而al5突變體的耐逆能力都低于野生型[27]。

從其它物種中的研究發(fā)現(xiàn)，從白菜中通過(guò)同源克隆得到的15條BrAL TFs研究發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)錄因子中有10條對(duì)生物脅迫的病菌產(chǎn)生抗病性，同時(shí)全部的ALs 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的非生物逆境產(chǎn)生抗逆性，說(shuō)明ALs在大白菜響應(yīng)生物和非生物脅迫中增強(qiáng)植物的抗逆性[28]。從水稻中克隆的植物同源結(jié)構(gòu)域 (PHD)-finger 家族轉(zhuǎn)錄因子 OsPHD1 的過(guò)量表達(dá)可提高水稻的耐逆性能。過(guò)表達(dá) Os PHD1 基因使轉(zhuǎn)基因株系對(duì)低溫、高鹽和干旱脅迫的耐受性分別提高 43.3%、60%和 25%，且在后代中獲得穩(wěn)定遺傳[29]。在蘿卜中的研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜的ALs也對(duì)干旱、低溫和高鹽有所響應(yīng)[30]。

因此，線果芥中的DF-14片段在線果芥抗旱途徑中發(fā)揮作用，上調(diào)表達(dá)，但具體調(diào)控機(jī)理尚不清楚，需要對(duì)轉(zhuǎn)錄因子DF-14做進(jìn)一步的抗逆功能研究。

對(duì)其中的DF-2(PREDICTED: Raphanus sativus nitrile-specifier protein 5-like,蘿卜的腈特異蛋白5),DF-6(Brassica napus protein CONTINUOUS VASCULAR RING 1，甘藍(lán)型白菜維管束蛋白)DF-14( Arabidopsis thaliana alfin-like 1 protein mRNA,擬南芥alfin-like 1蛋白的mRNA)熒光定量研究發(fā)現(xiàn)都是受干旱和鹽的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其中在干旱和鹽的脅迫下，轉(zhuǎn)錄因子和抗病蛋白的表達(dá)量都響應(yīng)脅迫，表達(dá)上調(diào)，但是基礎(chǔ)代謝受到影響，在干旱脅迫下，維管束蛋白下調(diào)表達(dá)，而在鹽脅迫下，短暫的上調(diào)表達(dá)后也是下調(diào)表達(dá)的。說(shuō)明在逆境脅迫下，植物會(huì)啟動(dòng)一些轉(zhuǎn)錄因子及抗病蛋白來(lái)應(yīng)對(duì)逆境，同時(shí)植物的自身代謝速度降低，生長(zhǎng)發(fā)育受到影響(抑制)。

4 結(jié) 論

4.1 對(duì)十字花科短命植物線果芥屬線果芥干旱脅迫下的mRNA差異顯示分析，共篩選獲得18條受干旱誘導(dǎo)或抑制表達(dá)的基因片段。其中基礎(chǔ)代謝、假想蛋白、抗病蛋白、未知蛋白、光周期蛋白及轉(zhuǎn)錄因子所占比例分別為38.89%、16.67%、16.67%、11.11%、11.11%和5.56%。

4.2 DF-2、DF-4及DF-16的確受干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。為線果芥中的轉(zhuǎn)錄因子，基礎(chǔ)代謝及抗病蛋白的基因克隆及功能驗(yàn)證打下前期基礎(chǔ)，也為新疆特有的野生抗逆植物資源的發(fā)掘提供理論依據(jù)。

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ApplicationofmRNADifferentialDisplayTechniqueinScreeningDroughtResistanceRelatedGenesinC.planisiliqua

ZHU Yan-fei, CHEN Quan-jia, QU Yan-ying

(KeyLaboratoryofAgriculturalBiotechnology,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

ObjectiveThe ephemeral speciesConringiaplanisiliquabelongs to Brassicaceae which grows in Xinjiang arid environment, which has strong drought resistance, but its drought resistance mechanism is not clear. In order to understand the mechanism of drought resistance and discover some excellent resistance genes from wild plant resources, it has laid an important foundation for further understanding the mechanism of drought resistance inconringiaplanisiliqua.MethodUsing the plant that has grown for three to four weeks treated by 20% PEG6000, total RNA of the leaves at 0 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 24 h and 48 h was extracted. Then the differentially expressed genes were screened by mRNA differential display techniques.ResultEighty primer combinations were used to screen the differentially expressed cDNAs, and a total of 18 differentially expressed cDNAs were found. They were named of DF1-DF18, 12 of the cDNAs were the up-regulated and 6 of them were down-regulated gene fragments. According to the gene function they were divided into 6 categories: basal metabolism, transcription factor, disease resistance protein, hypothetical protein, unknown protein and photoperiod protein. Most of them were the basal metabolism related genes. We analyzed the expression pattern of the DF-2,DF-6 and DF-14 under drought and salt stress, and the finding showed that the three genes were regulated by drought and salt.ConclusionEighteen of the drought-resistant genes were screened from ephemeral plantConringiaplanisiliqua. Three of the genes expression patterns were detected, they were induced by drought and salt stress.

Conringiaplanisiliqua; drought stress; mRNA different display

QU Yan-ying(1962-)，F(xiàn)emale，Native place: Shandong，professor, (E-mail)383006047@qq.com

S188

A

1001-4330(2017)10-1775-10

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.10.002

2017-07-25

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種重大專項(xiàng)“ 轉(zhuǎn)基因耐旱、 耐鹽新品種培育” (2013ZX08005-004)

朱燕飛(1988-)，女，江蘇南通人，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锟鼓婊蚬こ蹋?E-mail)1456359625@qq.com

曲延英(1962-)，女，山東人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊藁ǚ肿佑N，(E-mail)383006047@qq.com

Supported by: National special program for new varieties of genetically modified organisms "Transgenic drought tolerance and salt tolerant new variety breeding" (2013ZX08005-004)