程變巧，朱 琪*，王麗惠，洪發(fā)項，林偉國

（廈門大學附屬福州市第二醫(yī)院肝膽內科，福建 福州 350007）

·論 著·

Micro-122慢病毒抑制星狀細胞-T6上皮間質轉變

程變巧，朱 琪*，王麗惠，洪發(fā)項，林偉國

（廈門大學附屬福州市第二醫(yī)院肝膽內科，福建 福州 350007）

目的初步探討Micro -122對肝星狀細胞上皮間質轉變的影響。方法把Mirc0-122/GV369慢病毒載體轉染TGF-β1刺激的肝星狀細胞系T6后，熒光顯微鏡和QRT-PCR驗證轉染效果，QRT-PCR和免疫印跡分別檢測轉染前后E-Cadherin以及a-SMA的RNA及蛋白的表達情況。結果轉染Mirc0-122/GV369慢病毒載體的肝星狀細胞系T6內顯示明顯的綠色熒光，Mirc0-122顯示了上調表達。E-cadherin在mRNA和蛋白水平都顯示上調表達，相反a-SMA顯示了下調表達，與對照組相比，P＜0.05。結論Mirco-122在肝星狀細胞的表達上調可抑制肝星狀細胞的上皮間質轉變，有望作為肝纖維化的靶向抑制指標。

Micro-122；肝星狀細胞；肝纖維化；上皮間質轉變

肝纖維是各種肝病發(fā)展的必經階段，然而目前關于肝纖維化的干預手段還沒有明顯的作用。尋找肝纖維化的預測指標和治療評估指標可望改善肝纖維化的發(fā)展，提高檢測水平。

最近研究認為上皮間質轉變參與肝纖維化過程，在這一過程中可出現代表上皮成分的E-cadherin表達下調，代表間質成分的a-SMA等表達上調[1-2]。抑制肝星狀細胞的上皮間質轉變可有望阻止肝纖維化的發(fā)展[3-4]。MicroRNA（Micro）是一類內生的、在進化上高度保守的長約20～24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，是肝臟特異性miRNA，參與肝細胞生長代謝和應激反應等生理過程[5]。目前有研究認為Micro可能抑制肝星狀細胞的上皮間質轉變從而抑制肝纖維化的發(fā)展。因此本課題擬研究MicroRNA-122作用于活化的肝星狀細胞后對上皮間質轉變的影響，以此初步探討MicroRNA-122是否可作為肝纖維化的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MicroRNA-122慢病毒載體（15993-1）由上海吉凱基因公司構建，載體元件順序為Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin，滴度為4×108TU/ml，克隆位點為AgeI/ NheI，合成的microRNA-122基因序列（5'-3'），胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；Trizol、逆轉錄試劑盒（南京Vazyme公司）；熒光定量試劑盒（美國Genecopoeia公司）；引物由上海博尚生物技術有限公司合成并測序；單克隆兔抗人α-SMA（ab5694 abcam）、單克隆鼠抗人E-cadherin（ab76055 abcam）；HRP標記羊抗小鼠或抗兔IgG、FITC標志的羊抗兔IgG（EMAR公司）；細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；實時熒光定量PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

大鼠HSC-T6株由福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院施紅教授惠贈，用含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換1次培養(yǎng)液，細胞貼壁生長至培養(yǎng)瓶的70%～80%時傳代1次。

1.3 試驗方法

qRT-PCR法檢測MicroRNA-122、E-cadherin mRNA和α-SMA表達量 實驗組和對照組處理方法同細胞形態(tài)學觀察，培養(yǎng)24 h后，Trizol試劑提取兩組細胞的總RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，計算OD260 nm/OD280 nm比值檢驗RNA純度在1.8～2.2間再逆轉錄成cDNA，按95℃ 5 min預變性，95℃ 10 min，60℃ 30 s，共40個循環(huán)進行qRT-PCR反應。采用引物序列為：E-cadherin上游：5'-GCTCGCTGAACTCCTCTGA-3'，下游：5'-TCGCCGCCACCATACATA；miR-122序列為5'-GCTGTGGAGTGTGACAATGGTG-3'；U6（F）為5'-CGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，U6（R）為5'-GAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'，α-SMA 上游引物：5'-CCACTGCTGCTTCCTCTTC-3'，下游引物：5'-CGCCGACTCCATTCCAAT-3'.GAPDH上游：5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游：5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC；采用RQ=2-ΔΔCt來計算基因的相對表達量。

1.4 Western blot法檢測E-cadherin和a-SMA蛋白表達

以每孔30×104個細胞接種于六孔板，細胞貼壁生長12h后換液，在細胞培養(yǎng)箱中作用72 h，預冷的PBS洗滌3次，加適量裂解液（RIPA:PMSF=100:1），冰上裂解30 min，轉移至EP管，4℃、12000 rpm離心15 min后取上清；用50 μg/泳道的蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質，轉膜，5%脫脂牛奶封閉60 min，加入兔抗人E-cadherin和a-SMA（1:1000）、GAPDH（1:2000），4℃搖床孵育過夜，用TBST洗膜10 min×3次，加HRP標記的羊抗小鼠或抗兔IgG（1:2000）于室溫孵育1 h，再次用TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光并顯影。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對所有數據進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組樣本均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法進行兩兩比較，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 免疫熒光和PCR技術觀察mic-122慢病毒載體轉染效率以及表達情況

熒光相差顯微鏡觀察到miR-122轉染組的細胞的胞質和細胞核內都出現明亮的熒光，部分肝星狀細胞的胞核的熒光亮度強于胞質（圖1A，1B），兩圖重疊后觀察轉染效率約80%，說明microRNA-122慢病毒載體在肝星狀細胞-T6細胞系中成功轉染。QRT-PCR結果顯示，在轉染組microRNA-122 mRNA表達量（4.92±0.09）明顯高于陰性載體轉染組（1.21±0.08）和空白對照組（1±0.11），組間比較，F=7.127（圖2）。

圖1 HSC-T6在ENI.S.條件下的miR122轉染結果，MOI=10 A圖：轉染miR-122慢病毒載體前肝星狀細胞；B圖：轉染miR-122慢病毒載體后肝星狀細胞免疫熒光染色

圖2 QRT-PCR檢測microRNA-122 在轉染microRNA-122慢病毒載體的肝星狀細胞中的表達

2.2 Mic-122慢病毒載體轉染肝星狀細胞后可顯著上調E-cadherin的表達，而下調a-SMA的表達

為了研究micro-122對激活的肝星狀細胞上皮間質轉變是否有抑制作用，我們首先從基因水平對代表上皮成分的E-Cadherin和代表間質成分的a-SMA進行觀察分析，結果顯示，在Mic-122慢病毒載體轉染肝星狀細胞組，E-Cadherin表達（2.73±0.16 ）與空質粒組（1.17±0.12）和空白對照組（1±0.20）相比，表達呈上調趨勢，而a-SMA在轉染組表達（0.21±0.13）與空質粒組（0.92±0.12）和空白對照組（1±0.20）相比，表達呈下調趨勢。F值分別為16.208和7.145，組間比較，P＜0.05。這初步說明，micro-122在肝星狀細胞中的表達可以抑制其上皮間質轉變。

圖3 Qt-PCR檢測microRNA-122慢病毒轉染肝星狀細胞后E-cadherin和a-SMA的表達情況。A圖： E-cadherin在慢病毒轉染后表達。B圖：a-SMA在慢病毒轉染后表達

2.3 免疫印跡觀察

發(fā)現microRNA-122慢病毒轉染肝星狀細胞后可上調E-Cadherin，下調a-SMA蛋白的表達。從蛋白角度進一步說明了Micro-122上調表達可以抑制肝星狀細胞的上皮間質轉變。

a-SMA在正常肝星狀細胞組的相對表達量為0.96±0.12，在陰性載體組的相對表達量為0.88±0.14，而miR-122轉染組蛋白相對表達量為0.21±0.07，組間比較，F=7.145，有顯著統(tǒng)計學意義。（P＜0.05）。而E-cadherin在正常肝星狀細胞組的相對表達量為0.36±0.11，在陰性載體組的相對表達量為0.41±0.13，而在轉染組蛋白相對表達量為0.87±0.07，組間比較，F=10.145，有顯著統(tǒng)計學意義。（P＜0.05）

圖4 免疫印跡觀察E-cadherin蛋白和a-SMA在轉染microRNA-122慢病毒載體的肝星狀細胞中的表達。圖A：a-SMA在不同處理肝星狀細胞中的表達。圖B：E-cadherin在不同處理肝星狀細胞中的表達。

3 討 論

肝星狀細胞的活化是肝纖維化、肝硬化發(fā)展的主要原因，選擇有效的阻斷肝纖維化發(fā)展，也就是說抑制肝星狀細胞的活化和增殖是阻斷肝纖維化發(fā)展的關鍵。上皮間質細胞轉化一直認為是腫瘤細胞特有的特點。最近相序在腎纖維化、肺纖維化以及腹膜纖維組織中均顯示有上皮間質轉化特點[3-4]。畢婉蓉[6]通過CCL4誘導小鼠肝纖維化模型中觀察到代表上皮成分的E-鈣粘附素的表達下調，代表間質成分的α-SMA表達上調，直接說明肝纖維化中也存在上皮間質轉化。

我們課題組前期試驗用TGF-β1刺激肝星狀細胞的活化，發(fā)現在激活的肝星狀細胞中代表上皮成分的E-Cadherin表達下調，F-actin熒光聚集形成粗大的應力纖維絲，沿細胞長軸成束狀樣分布，而代表間質成分的a -SMA以及vimentin、N-Cadherin等明顯上調。這也進一步說明了肝星狀細胞可以發(fā)生上皮間質轉變。EMT是一個動態(tài)的可逆過程，以EMT為靶標的抗纖維化治療，有望成為肝纖維化臨床治療的一個新策略。

Micro是一類內生的、在進化上高度保守的長約20～24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，是肝臟特異性miRNA，參與肝細胞生長代謝和應激反應等生理過程[4-5]。目前研究發(fā)現，多種miRNA在肝纖維化進程中差異表達。如現已發(fā)現的miR-199a，miR-199a*，miR-200a和miR-200b在CCl4所致肝纖維化動物肝組織與人的肝纖維化組織中均差異性表達，并且與肝纖維化分級顯著相關[7-8]。miR-122是最早發(fā)現的組織特異性表達的microRNA之一，它在肝臟中特異性表達，約占了所有肝臟表達的microRNAs的70%[9-10]。

本課題通過構建Micro-122慢病毒載體并成功轉染活化的肝星狀細胞，觀察Micro-122對肝星狀細胞上皮間質調控的影響。結果發(fā)現，無論從基因水平和蛋白水平，均發(fā)現E-cadherin在慢病毒載體轉染組的表達明顯高于在空質粒組和空白對照組的表達。而a-SMA的表達呈下調表達，這說明micro-122可以抑制肝星狀細胞的上皮間質轉變。

通過上述實驗，我們只是初步探討了micro-122對肝星狀細胞上皮間質的調控作用。Micro-122如何調控肝星狀的上皮間質轉變還需要深入的研究。因為肝星狀細胞激活后的調控不會是單一的調控，往往是一個復雜的信號網絡相互作用，相互制約，因此進一步完善micro-122在肝纖維化中的調控作用有望成為阻斷肝纖維化發(fā)展的關鍵靶點。

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Inhibition of epithelial mesenchymal transition of hepatic stellate cells T-6 by micro-122 lentiviral vector

CHENG Bian-qiao, ZHU Qi, WANG Li-hui, HONG Fa-xiang, LIN Wei-guo
(The Second Hospital of Fuzhou Affiliated Xiamen University,Fujian Fuzhou 350007,China)

ObjectivePreliminary discussing the influence of micro-122 on the epithelial mesenchymal transition of hepatic stellate cells T-6.MethodsWe transfect Micro-122/GV369 lentiviral vector into hepatic stellate cells line T6 stimulated by TGF - beta 1,fluorescent microscope was used to transfection sfficiency, QRT-PCR was used to detect expression of Micro-122 mRNA、E-cadherin mRNA and a-SMA mRNA .The protein expression bouth E-cadherin and a-SMA were tested by Western blot.ResultsThere was obviously showing green fluorescence in Micro-122/T6 GV369 lenti viral vector, the nucleotide expressions of Micro-122、E-Cadherin in hepatic stellate cells transfected Micro-122/T6 GV369 lentiviral vector were higher than in control groups.But the expression of a-SMA was obvious down-regulation companying with two control groups,P＜0.05. The result of Western blot was showed up-regulation of E-Cadherin but down-regulation of a-SMA in hepatic stellate cells transfected Micro-122/T6 GV369 lentiviral vector .there was statistical significanceP＜0.05.ConclusionThe up-regulation expression of Micro-122 in hepatic stellate cells could inhibit its epithelial mesenchymal transition,which was a therapeutic target of hepatic fibrosis.

Micro-122; hepatic stellate cells; Hepatic fibrosis; Epithelial mesenchymal transition

R575.2

A

ISSN.2095-8242.2017.38.7327.03

福州市科技計劃項目（NO.：2014-S-137-1，2014-S-137-5）；福建省科技廳引導性項目（NO.：2015D002）

朱琪

本文編輯：吳玲麗