賈少勛，茹杏麗，王 一

陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科(西安710068)

△通訊作者

法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡、分化及侵襲作用的影響*

賈少勛，茹杏麗，王 一△

陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科(西安710068)

目的： 探討ROCK酶抑制劑法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及侵襲作用的影響。方法： 用臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)繪制法舒地爾作用下，HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；MTT法檢測(cè)法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)CD11b抗原表達(dá)，硝基四唑氮藍(lán)(NBT)還原實(shí)驗(yàn)分析法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞分化影響。采用AnnexinV/PI雙染試劑盒上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。利用Transwell穿孔板法觀察法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞侵襲力的影響。結(jié)果： 法舒地爾抑制HL-60細(xì)胞呈濃度和時(shí)間依賴性、法舒地爾作用于HL-60細(xì)胞12、24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(89.65±12.45)μmol/L、(69.21±15.48) μmol/L、(65.29±20.31) μmol/L以及(58.54±10.02)μmol/L。法舒地爾誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡呈時(shí)間和劑量依賴性。法舒地爾可增加HL-60細(xì)胞后硝基四唑氮藍(lán)陽(yáng)性率，上調(diào)CD11b單核分化抗原的表達(dá)。法舒地爾明顯抑制HL-60細(xì)胞穿透Transwell小室，侵襲到穿孔膜外。結(jié)論：法舒地爾有抑制HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)分化及抑制侵襲等多種抗白血病作用。

法舒地爾是一種ROCK激酶抑制劑，主要作用抑制細(xì)胞內(nèi)ROCK活性，從而抑制血管收縮，臨床的主要適應(yīng)證為蛛網(wǎng)膜下腔出血所致血管痙攣，而ROCK激酶在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且影響預(yù)后[1-2]。已有的研究提示法舒地爾可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞侵襲[3-4]。本研究擬觀察法舒地爾對(duì)白血病HL-60細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響，以期將法舒地爾作為抗白血病藥物提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

材料和方法

1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人髓系白血病細(xì)胞系HL-60(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所王敏教授惠贈(zèng))；法舒地爾購(gòu)于天津紅日藥業(yè)；細(xì)胞培養(yǎng)液RP1640及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；小鼠抗人CD11b-PE單抗及IgG-PE對(duì)照抗體、凋亡檢測(cè)試劑盒、Tanswell穿孔板及Annexin V-FADD 凋亡檢測(cè)試劑盒均為美國(guó)B-D公司產(chǎn)品；四唑氮蘭(NBT)、佛波醇(TPA)及于噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

2 法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞增殖活性檢測(cè) ①錐蟲(chóng)藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)：調(diào)整HL-60細(xì)胞密度為2×105/ml,分別接種于含不同濃度法舒地爾(分別為0、25、50、75、100 μmol/L)培養(yǎng)液中,每瓶含5 ml。培養(yǎng)24、48、72 h,吸取10 μl 0.4%臺(tái)盼藍(lán)置于EP管中,再吸取90 μl待染色的細(xì)胞懸液,混勻靜置約3 min后用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。每次每瓶計(jì)數(shù)3次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。②MTT法檢測(cè)法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)：調(diào)整HL-60細(xì)胞密度為5×104接種于96孔無(wú)菌培養(yǎng)板中，每孔200 μl。實(shí)驗(yàn)組和空白組的設(shè)置同方法①。每組每個(gè)濃度下設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)24、48、72 h后加10 μl MTT(10 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心棄上清液，每孔加入150 μl DMSO終止反應(yīng)，微振蕩后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，計(jì)算抑制率并繪制劑量效應(yīng)曲線，求出法舒地爾對(duì)HL-60增殖抑制率、求出細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)

3 四唑氮蘭(NBT)還原實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以1×105ml的密度接種于4個(gè)25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加細(xì)胞懸液5 ml,其中一瓶為對(duì)照，其余3瓶分別加入法舒地爾使其細(xì)胞懸液中的終濃度分別為0、25、75、100 μmol/L作用96 h后,離心收集細(xì)胞,加入終濃度為1.0 mg/ml的NBT和20 ng/ml的佛波醇(TPA),再在培養(yǎng)箱中37℃孵育30 min，甩片機(jī)將細(xì)胞均勻涂片,光鏡下觀察并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞被染成藍(lán)紫色的為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜上CD11b 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，HL-60細(xì)胞細(xì)胞密度為2×105/ml，經(jīng)25、50、75 μmol/L濃度處理72 h，用1×PBS洗滌2次，再各加入5 μl小鼠抗人CDllb-PE，并以小鼠抗人IgG-PE單克隆抗體為質(zhì)控對(duì)照，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞以2×105/ml濃度每孔5 ml培養(yǎng)于6孔板中，將法舒地爾按照0、25、50、75 μmol/L處理6、12、24、48 h，細(xì)胞收集離心后用PBS重懸洗滌2次；按照試劑盒

說(shuō)明，加入10 μl Annexin V的混合物、5 μl FADD,混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀后檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 按照產(chǎn)品說(shuō)明,將直徑為8 μm Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，構(gòu)建體外的白血病細(xì)胞的遷移模型。Transwell小室上室中加入不含血清的RPMI1640重懸，含HL-60細(xì)胞濃度為1.0×107/ml的無(wú)血清的RPMI1640細(xì)胞液100 μl,下室中加入含12%血清的RPMI1640培養(yǎng)液600 μl；上室中分別加入法舒地爾濃度為0、50、100 μmol/L,12 h后計(jì)數(shù)下室的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果通過(guò)SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。均值間比較使用￡檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響 見(jiàn)圖1。不同濃度法舒地爾(0、25、50、75 μmol/L)作用于HL-60細(xì)胞24、48、72、96 h均能明顯抑制其增殖，隨著藥物濃度的增大抑制效果逐漸增強(qiáng)，法舒地爾抑制HL-60細(xì)胞增殖呈濃度和時(shí)間依賴性。

圖1 法舒地爾對(duì)HL-60 細(xì)胞的增殖抑制作用

2 法舒地爾對(duì)HL-60 細(xì)胞IC50的影響 12、24、48、72 h的IC50值分別為(89.65±12.45)μmol/L、(69.21±15.48) μmol/L、(65.29±20.31) μmol/L及(58.54±10.02)μmol/L，法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞的IC50值隨時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)明顯降低。

3 法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表1。25、50、75 μmol/L濃度的法舒地爾作用于HL-60細(xì)胞6、12、24、48 h均可檢測(cè)到細(xì)胞的明顯凋亡，且凋亡呈現(xiàn)明顯時(shí)間和劑量依賴性結(jié)果。

表1 法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡率的影響

注：對(duì)照組為0 μmol/L,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，*P<0.05

4 法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞分化的影響 法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞 NBT還原能力的影響：濃度為25、50、75 μmol/L的法舒地爾處理HL-60細(xì)胞72 h可見(jiàn)藍(lán)染細(xì)胞百分率(NBT陽(yáng)性率)為分別為(13.20±3.85)%、(22.7±6.18)%以及(24.84±2.36)% 均顯著高于對(duì)照組(7.58 ±1.62)%(P<0.05)。法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞單核分化抗原CD11b表達(dá)的影響：用法舒地爾以25、50、75 μmol/L濃度處理HL-60細(xì)胞72 h后CD11b陽(yáng)性率分別為(17.20±1.31)%,(24.46±2.61)%及(45.43±1.58)%均顯著高于對(duì)照組(7.17±1.04)% (P<0.05)。

5 法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞遷移的影響 用法舒地爾分別以25、50、75 μmol/l濃度處理Transwell小室上室HL-60細(xì)胞24 h后結(jié)果遷移到下室細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度的增大逐漸減少，分別為(4.56±1.08)×105/孔、(3.21±0.29)×105/孔以及(2.59±0.11)×105/孔，對(duì)照組下室細(xì)胞數(shù)為(5.35±0.54)×105/孔，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

本研究觀察了法舒地爾對(duì)白血病HL-60細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及侵襲力的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)50～100 μmol/L濃度的法舒地爾對(duì)HL-60細(xì)胞具有明顯抑制增殖且呈時(shí)間和劑量依賴性，低于此濃度的法舒地爾可有效誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。細(xì)胞分化阻滯在白血病的發(fā)生中起重要作用，因此誘導(dǎo)細(xì)胞分化是白血病治療重要機(jī)制之一，本研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾作用72 h后，HL-60細(xì)胞對(duì)NBT還原能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)使明顯上調(diào)HL-60細(xì)胞單核細(xì)胞分化抗原CD11b。ROCK活性增強(qiáng)，可使細(xì)胞骨架發(fā)生變化，從而導(dǎo)致腫瘤遷徙和浸潤(rùn)。有研究結(jié)果表明法舒地爾可以有效抑制包括膀胱癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤浸潤(rùn)和侵蝕。通過(guò)Tanswell小室模仿白血病浸潤(rùn)模型的建立，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)法舒地爾可顯著減少HL-60細(xì)胞的侵襲。

法舒地爾有減少血管痙攣，而在臨床上主要用于蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的血管痙攣以及缺血性腦病，有研究結(jié)果表明法舒地爾可以有效保護(hù)心臟免受蒽環(huán)類藥物的損害[8]。在急性白血病的化療中多采用的方案為蒽環(huán)類藥物聯(lián)合阿糖胞苷[9]。本研究結(jié)果提示法舒地爾可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)分化以及減少侵襲等多種作用產(chǎn)生明顯抗白血病作用。如果將法舒地爾與蒽環(huán)類化療藥物聯(lián)合用于急性白血病的治療中，有可能在提高白血病療效的同時(shí)，可能明顯減少化療藥物對(duì)心臟功能的損害。

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Effectsoffasudilonproliferation,apoptosis,differentiationandcellmigrationofHL-60cell

Jia Shaoxun,Ru Xinglin,Wang Yi.

Department of Hematology, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：To investigate the effect of Rho kinase inhibitor fasudil on proliferation，differentiation ,apoptosis and migration of HL-60 cells. Methods：Cell growth curve was analyzed by trypan blue staining, and the inhibitory effect of fasudil on the proliferation of HL-60 cells MTT assay. The differentiation of HL-60 cells exposed to different concentrations of fasudil was evaluated by expression of CD11b using flow cytometry and NBT reduction test. Cell apoptosis rate detected with AnnexinV/FADD double staining by flow cytometry. Trans well chamber in vitro tumor cell migration model was observed the effects of fasudil on leukemic cell migration. Results ：Fasudil inhibited growth of HL-60 cellsin a time-and dose -dependent manner .When HL-60cells was treated by fasudil at 12h, 24h,48h and 72h , the median inhibitory concentration(IC50)were(89.65±12.45)μmol/L,(69.21±15.48) μmol/L,(65.29±20.31) μmol/L and(58.54±10.02) μmol/L, respectively. Fasudil induced apoptosis of HL-60 cells in time-and-dose effect.Fasudil could upregulate the expression of CD11b of HL-60 cells and increased position of NBT in HL-60 cells .Fasudil reduced Significantly fewer HL-60 cells were migrated into the lower compartment. Conclusion: Fasudil can inhibit the proliferation of leukemic cells and induce HL-60 cells apoptosis, promote the differentiation of leukemia cells, can inhibit leukemic cells distant metastasis.

HL-60 cells Cell proliferation Apoptosis Cell differentiation @Fasudil

*陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012JM4050)

HL-60細(xì)胞 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分化 @法舒地爾

R733

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.003

(收稿：2017-01-20)