林 陶，李婕羚，付遠(yuǎn)洪，楊衛(wèi)靈

(1. 貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001；2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 食品安全學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

無籽刺梨與野生刺梨果實(shí)的氨基酸含量及組成

林 陶1，李婕羚1，付遠(yuǎn)洪1，楊衛(wèi)靈2*

(1. 貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001；2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 食品安全學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

為更深入的研究和開發(fā)利用貴州無籽刺梨和刺梨資源，本研究采用鹽酸水解法，以正亮氨酸為內(nèi)標(biāo)物，異硫氰酸苯酯(PITC)為柱前衍生劑，用高效液相色譜測定無籽刺梨與野生刺梨的氨基酸的含量，對其進(jìn)行組成分析和營養(yǎng)評價(jià)。結(jié)果表明，三種果實(shí)樣品均含有16種氨基酸，成熟無籽刺梨與刺梨比較，無籽刺梨的總氨基酸、必需氨基酸、兒童必需氨基酸、味覺氨基酸、藥效氨基酸、支鏈氨基酸略高；氨基酸組成分析中，除了Cys+Met外，其它均符合WHO/FAO氨基酸模式譜。

高效液相色譜法；無籽刺梨；刺梨；氨基酸；營養(yǎng)評價(jià)

無籽刺梨(Rosa sterilis S. D. Shi)與刺梨(Rosa roxburghii Tratt)同屬薔薇科植物，為多年生落葉攀援性灌木，與廣泛分布的刺梨相比，無籽刺梨是貴州特有種[1]。目前，關(guān)于這兩種植物研究如總黃酮、維生素C、超氧化物歧化酶、單寧、揮發(fā)性香氣成分測定，以及染色體、基因克隆及表達(dá)分析研究等已有部分報(bào)道[2-6]，而有關(guān)它們氨基酸方面的研究較少[8]。作為營養(yǎng)豐富的食材，刺梨已經(jīng)廣泛用于食品、藥品行業(yè)；而無籽刺梨口感清香爽口，酸甜適度，被譽(yù)為“新山珍”[9]，是研究熱門的藥食兩用植物之一。本研究采用異硫氰酸苯酯柱前衍生法，用高效液相色譜測定無籽刺梨和野生刺梨中的氨基酸組成及其含量，以期在其醫(yī)療保健、營養(yǎng)及新產(chǎn)品開發(fā)等領(lǐng)域，為進(jìn)一步開發(fā)利用兩種植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥材

野生刺梨成熟果采集于9月份，無籽刺梨成熟果采集于11月，采集地點(diǎn)均為貴州省興仁縣。

1.1.2 儀器與試劑

Agilent 1200 高效液相色譜儀、DAD檢測器、Agilent色譜工作站(安捷倫科技有限公司)，恒溫干燥箱(金南儀器制造有限公司)，AL-204電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本ELYEA，N-1001)。

天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)對照品(美國Sigma-Aldrich公司)；正亮氨酸(Nle)、PITC衍生劑、三乙胺(Bonna-Agela Technologies 公司)。乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

Agilent 1200 HPLC, DAD檢測器、Agilent色譜工作站(安捷倫科技有限公司)，恒溫干燥箱(金南儀器制造有限公司)，AL-204電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本ELYEA，N-1001)。

1.2 方法

1.2.1 測定條件

色譜柱為Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，進(jìn)樣量2 μL，體積流量1 mL·L-1，柱溫35 ℃，檢測波長254 nm；流動相A為乙腈-0.1mol·L-1乙酸鈉溶液-乙酸(7:93:0.05)，流動相B為乙腈-水(80:20)，梯度洗脫程序：3～15 min，0%～12%B；15～16 min，12%～24%B；16%～31 min，24%～30%B；31%～32 min，30%～60%B；32～40 min，60%～80%B。

1.2.2 氨基酸混合對照溶液制備

分別精密稱取各氨基酸對照品適量，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液制成每毫升含天冬氨酸1.007 mg、谷氨酸1.073 mg、絲氨酸0.794 mg、甘氨酸0.694 mg、組氨酸0.740 mg、精氨酸0.973 mg、蘇氨酸0.757 mg、丙氨酸0.744 mg、脯氨酸1.154 mg、酪氨酸0.687 mg、纈氨酸0.707 mg、蛋氨酸0.734 mg、異亮氨酸1.057 mg、亮氨酸0.790 mg、苯丙氨酸0.684 mg、賴氨酸0.724 mg的混合對照品儲備液。使用時候?qū)湟合♂?0倍作為氨基酸對照品工作液。

1.2.3 供試品溶液制備

分別取無籽刺梨與刺梨(除籽)果實(shí)適量用組織搗碎機(jī)搗碎成漿，精密稱定0.3g，置聚四氟乙烯水解罐中，精密加入6 mol·L-1鹽酸溶液(含0.1%苯酚)10 mL，于恒溫烘箱中110 ℃水解24 h，取出冷卻，過濾于25 mL容量瓶中，用純凈水洗滌濾渣并定容。將溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上65 ℃濃縮，用0.1 mol·L-1鹽酸溶解，將溶液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，定容。

1.2.4 樣品衍生化反應(yīng)

分別準(zhǔn)確移取對照品溶液、供試品溶液各200 μL，置 1.5 mL離心管中，準(zhǔn)確加入1.0 mg·L-1正亮氨酸溶液20 μL，再加入0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h，加入正己烷400 μL，快速混勻器振蕩混勻后，靜置10 min，用注射器吸取下層溶液, 經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。

1.2.5 進(jìn)樣分析

取衍生化完以后的氨基酸對照品和供試品溶液上機(jī)測試，進(jìn)樣2μL，記錄譜圖峰面積，以正亮氨酸為內(nèi)標(biāo)，按照內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中各氨基酸的含量。

1.2.6 氨基酸組成和營養(yǎng)分析

根據(jù)1973年WHO/FAO提出的蛋白質(zhì)評價(jià)方法[10]，分別計(jì)算必需氨基酸與總氨基酸的百分比值(E/T)、必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(E/N)，將這兩個值與推薦值比較，得出所含氨基酸是否符合理想蛋白質(zhì)要求。根據(jù)WHO/FAO氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式譜，計(jì)算Thr、Val、Leu、Ile、Lys、Phe+Tyr、Met+Cys與總氨基酸的百分比含量進(jìn)行比較，得出是否符合人體蛋白質(zhì)組成，判斷其營養(yǎng)價(jià)值。計(jì)算味覺氨基酸(鮮味、甜味、芳香族)，藥效氨基酸，支鏈氨基酸等功能氨基酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖與樣品譜圖比對

圖1 混合氨基酸對照品(A)、無籽刺梨(B)和野生刺梨樣品樣品(C)HPLC色譜圖

Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A) , Rosa sterilis sample(B) and wild Rosa roxburghii sample(C)

氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)譜圖為圖1A，樣品譜圖為圖1B和1C，16號峰為正亮氨酸的內(nèi)標(biāo)峰。由色譜圖出峰時間定性，無籽刺梨與刺梨均無13號胱氨酸的色譜峰，均含有16種氨基酸，色氨酸被酸水解破壞均未測出[11]。按照出峰順序依次為：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)。

2.2 氨基酸組成與含量

由氨基酸含量分析可知，無籽刺梨與野生刺梨均含有人體必需氨基酸7種(Thr、Val、Phe、Met、Ile、Leu、Lys)，其中，無籽刺梨的總氨基酸含量最高，為61.70 mg·g-1。兩種植物的果期存在差異，無籽刺梨晚于刺梨的成熟期。分析結(jié)果顯示，無籽刺梨的氨基酸含量高于野生刺梨(表1)。

表1 刺梨與無籽刺梨果實(shí)氨基酸組成與含量

注：a人體必需氨基酸；b兒童必需氨基酸；c味覺氨基酸；d藥效氨基酸；e支鏈氨基酸。T總氨基酸；E必需氨基酸；N非必需氨基酸；CE兒童必需氨基酸。

2.3 氨基酸的組成分析

2.3.1 必需氨基酸比例

FAO/WHO在1973年提出的理想蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)：E/T在40%左右，E/N在0.60以上[10]。根據(jù)表1分析，無籽刺梨的人體必需氨基酸的含量高于野生刺梨的氨基酸，而兒童氨基酸則略低于野生刺梨。無籽刺梨成熟果實(shí)中的E/T值為38.03%，E/N/值為61.38%，無籽刺梨中的蛋白質(zhì)接近理想蛋白質(zhì)的要求。野生刺梨的E/T值與E/N值分別為36.26%、56.88%，略低于無籽刺梨，但也接近理想蛋白質(zhì)組成。兩種植物的兒童氨基酸含量比較，野生刺梨為10.49%，高于無籽刺梨的7.52%。

2.3.2 人體必需氨基酸比例與模式譜的比較

由表2可知，與氨基酸模式譜比較，無籽刺梨的Met+Cys低于氨基酸模式譜，其他指標(biāo)基本符合WHO/FAO氨基酸標(biāo)準(zhǔn)。野生刺梨中Met+Cys低于模式譜，而Phe+Tyr接近于模式譜要求。Lys為人體第一限制性氨基酸，缺乏Lys會影響其他體內(nèi)蛋白的合成，影響大腦發(fā)育[12]；總體上兩種植物中Lys的量均高于WHO/FAO氨基酸模式譜，但無籽刺梨中的Lys含量略高于野生刺梨。其豐富的賴氨酸含量，也是現(xiàn)在保健食品的依據(jù)之一。

表2 人體必需氨基酸的比例與WHO/FAO氨基酸模式譜的比較

Table2 Comparison of essential amino acid composition in samples and WHO/FAO recommended pattern

注：未檢出Cys，僅為Met的含量

2.4 藥效氨基酸分析

藥效氨基酸有Asp、Glu、Gly、Met、Leu、Tyr、Phe、Lys、Arg 9種，這些氨基酸在人體的正常生理活動中發(fā)揮著重要的作用。Asp能緩解疲勞；Glu通過合成谷氨酰胺，解除氨毒害，具有健腦益智作用[13]；Arg能增強(qiáng)免疫、促進(jìn)胰島素釋放從而治療糖尿病[14]；Gly具有抗炎、護(hù)肝、提高運(yùn)動能力的作用[15]；Met能預(yù)防脂肪肝[16]；Leu能促進(jìn)胃液分泌；Lys是大腦神經(jīng)細(xì)胞再生的第一限制性氨基酸，缺乏影響大腦發(fā)育[12]。由表1可知，無籽刺梨與野生刺梨中的藥效氨基酸分別為41.3 mg·g-1、32.9mg·g-1，藥效氨基酸的含量都在總氨基酸的60%左右。由于特殊功效氨基酸的存在，使兩種植物在醫(yī)療保健食品方面具有很廣闊的開發(fā)前景。

2.5 味覺氨基酸分析

氨基酸是維系人體生命活動的重要物質(zhì)，它不僅具有各種生理功能，還在食品的呈味方面扮演著十分重要的角色[16]。鮮味氨基酸有Asp、Glu，它們含量多少直接影響了食物的鮮美程度；甜味氨基酸有Ala、Gly、Ser、Pro，它們的含量決定著食物的甜美程度；芳香族氨基酸有Phe、Tyr，能增進(jìn)食物的香味，它們含量的多少決定著食物的香美程度。從表3可知，無籽刺梨與野生刺梨的鮮味氨基酸分別為14.07 mg·g-1、13.92 mg·g-1，兩者的鮮味氨基酸的含量很接近。但是甜味類氨基酸和芳香類氨基酸都是無籽刺梨的優(yōu)于野生刺梨，無籽刺梨的甜味氨基酸為19.05 mg·g-1，芳香類氨基酸為6.16 mg·g-1；野生刺梨的甜味氨基酸為12.29 mg·g-1，芳香氨基酸為2.96 mg·g-1。目前，無籽刺梨與刺梨可加工果脯、果汁、果醬等食品，除了與其豐富的Vc、SOD等營養(yǎng)成分以外[13]，其自身味道也是一個的因素，而它們所含的味覺氨基酸在它們的呈味過程中起到了不可忽視的作用。

表3 味覺氨基酸含量 mg﹒g-1

2.6 支鏈氨基酸分析

支鏈氨基酸(BCAA)包括Leu、Ile和Val，研究證實(shí)，支鏈氨基酸能有效改善應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體糖利用障礙、減少骨骼肌蛋白分解代謝、增加肝和骨骼肌蛋白合成；可減輕病人肝性腦病的程度，減輕肝的負(fù)擔(dān)，維護(hù)肝功能；還能提高運(yùn)動耐力、恢復(fù)肌肉疲勞、保護(hù)心臟[12，18-19]。BCAA被推薦用于肝性腦病、感染、創(chuàng)傷等應(yīng)激病人的營養(yǎng)治療[18-19]。無籽刺梨中支鏈氨基酸的含量為12.86 mg·g-1，野生刺梨中的支鏈氨基酸為9.89 mg·g-1(表1)。其豐富的支鏈氨基酸含量，在作為護(hù)肝保健品等的領(lǐng)域值得人們深入開發(fā)以及研究。

3 結(jié)論與討論

3.1 通過無籽刺梨與野生刺梨成熟果實(shí)的氨基酸對比分析，無籽刺梨各種類型的氨基酸的總量高于野生刺梨。與WHO/FAO氨基酸模式譜比較，無籽刺梨與野生刺梨中Cys+Met不符合模式譜，其它的基本符合氨基酸模式譜要求?？傮w上比較，無籽刺梨與野生刺梨的氨基酸組成都接近理想蛋白質(zhì)，與人的蛋白質(zhì)組成相似，均具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。氨基酸的種類是否齊全與其含量影響著果品的營養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值，所以氨基酸的含量可作為鑒別果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣的依據(jù)之一[20]。目前關(guān)于無籽刺梨基地土壤質(zhì)量的研究較多，涉及到無籽刺梨基地土壤肥力、養(yǎng)分狀況和重金屬風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)等方面[21-23]，無籽刺梨氨基酸等營養(yǎng)指標(biāo)與土壤養(yǎng)分的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

3.2 本研究采用高效液相色譜法測定的味覺氨基酸的組成無籽刺梨與野生刺梨的鮮味氨基酸的含量很接近，有學(xué)者采用氨基酸分析儀分析表明，刺梨具有更高的營養(yǎng)價(jià)值[6]，這可能與供試材料有關(guān)，前者采用的“貴農(nóng)5號”刺梨是從野生刺梨優(yōu)良單株無性系選育出的新品種，豐產(chǎn)性和品質(zhì)均高于野生刺梨[24]，本研究材料取自野生刺梨。因?yàn)闊o籽刺梨其自身的果實(shí)特性，綜合其營養(yǎng)保健價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，無籽刺梨在藥食領(lǐng)域有著很好的發(fā)展前景。

[1] 韋景楓,程友忠,蒙先舉,等.無籽剌梨生物學(xué)特性觀察[J].中國林副特產(chǎn), 2012, 6(6): 27-29.

[2] 侯 璐,錢 和.高效液相色譜法測定刺梨中維生素的含量[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(8): 311-313.

[3] 付慧曉, 王道平, 黃麗榮, 等. 刺梨和無籽刺梨揮發(fā)性香氣成分分析[J]. 精細(xì)化工, 2012, 29(9): 875-878.

[4] 吳洪娥, 金 平,周 艷, 等. 刺梨與無籽刺梨的果實(shí)特性及其主要營養(yǎng)成分差異[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(8): 221-223.

[5] 吳小瓊,羅 會,金吉林,等. 超臨界CO2萃取無籽刺梨揮發(fā)油及GC-MS分析[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,10:98-101.

[6] 林 源, 唐軍榮, 張 穎,等.無籽刺梨染色體數(shù)目觀察[J]. 中國南方果樹, 2015, 44(1): 76-78.

[7] 劉 松, Li Yi, 趙德剛. 無籽刺梨RksAGL基因克隆及表達(dá)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2015, (3): 579-586.

[8] 魯 敏,安華明,趙小紅. 無籽刺梨與刺梨果實(shí)中氨基酸分析[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(14):118-121.

[9] 劉 松,趙德剛.無籽刺梨研究進(jìn)展[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào), 2014, 33(1): 76-80.

[10] FAO/WHO. Energy and protein requirements: report of the Joint FAO/WHO Ad Hoc Expert Committee[R].FAO Nutrition Meeting Report Series No.52, Rome and WHO Technical Report Series No.522, Geneva, 1973.

[11] 鄒元鋒, 陳興福, 楊文鈺, 等. 不同生長年限黨參氨基酸組分分析及營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(6): 146-150.

[12] 陳宗禮,賀曉龍,張向前,等.陜北紅棗的氨基酸分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通, 2012, 28(34): 296-303.

[13] 劉 剛,王 輝,周本宏.松茸氨基酸含量的測定及營養(yǎng)評價(jià)[J]. 中國食用菌, 2007, 26(5): 51-52.

[14] 桑軍亮, 田科雄. 精氨酸的生理作用及其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 養(yǎng)殖與飼料, 2010(7): 70-74.

[15] 宋彥梅, 尹秋響, 王靜康. 甘氨酸的應(yīng)用及生產(chǎn)技術(shù)[J]. 氨基酸和生物資源, 2003, 25(2): 55-60.

[16] 張偉敏, 魏靜, 施瑞誠, 等. 諾麗果與熱帶水果中氨基酸含量及組成對比分析[J]. 氨基酸和生物資源, 2008, 30(3): 37-41.

[17] 武彥文, 歐陽杰. 氨基酸和肽在食品中的呈味作用[J]. 中國調(diào)味品, 2001, 1(1): 21-24.

[18] Zhang X J, Chinkes D L, Wolfe R R. Leucine supplemenlation has an anabolic effect on proteins in rabbit skin and muscle [J]. Journal of Nutrition, 2004, 134(12): 3313-3318.

[19] 楊曉軍, 馮濤, 馬玉杰, 等. 高支鏈氨基酸腸外營養(yǎng)支持對危重癥病人肝腎功能保護(hù)作用的臨床對照研究[J]. 腸外與腸內(nèi)營養(yǎng), 2012, 19(6): 347-350.

[20] 王婭麗, 李永華, 王鈺,等. 3種扁桃屬植物營養(yǎng)成分分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 39(7):127-129.

[21] Yang H, Hu J W, Huang X F, et al. Risk Assessment of Heavy Metals Pollution for Rosa sterilis and Soil from Planting Bases Located in Karst Areas of Guizhou Province. Applied Mechanics and Materials, 2015, 700: 475-481.

[22] 楊 皓,胡繼偉,黃先飛, 等. 喀斯特地區(qū)金刺梨種植基地土壤肥力研究[J]. 水土保持研究, 2015, 22(3): 50-55.

[24] 樊衛(wèi)國,向顯衡,安華明,等. 刺梨新品種'貴農(nóng)5號'[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2011, 38(8): 1609-1610.

DeterminationofAminoAcidsinRosaSterilisandWildRosaRoxburghiibyHPLC

LinTao1,LiJieling1,FuYuanhong1,YangWeiling2

(1. Key Laboratory for Information System of Mountainous Area and Protecion of Environment of Guizhou Province, Guiyang 550001,China；2. College of Food Safety, Guizhou Medcial University, Guiyang 550001, Chnia)

To provide scientific basis for further research and development for Rosa sterilis and Rosa roxburghii in Guizhou, this paper adopt hydrochloric acid hydrolysis method, using norleucine as the internal standard, then derivatized with phenylisothiocyanate (PITC) and determined by HPLC, analysis the amino acids composition and nutritional evaluation at last. Results showed that three samples contained 16 kinds of amino acids. Compared with Rosa roxburghii, total amino acid, essential amino acids, children's essential amino acids, taste amino acids, pharmacodynamics amino acids and branched chain amino acid in the fruit of Rosa sterilis were higher. Analysis of amino acid composition, in addition to Cys+Met, others are in accordance with WHO/FAO amino acid pattern spectrum.

high performance liquid chromatography (HPLC); Rosa sterilis; Rosa roxburghii; amino acids; nutritional evaluation

2017-08-28

州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY[2015]3022-1號)，教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1227)，貴州省林業(yè)廳項(xiàng)目(黔林科合[2016]09)，貴州師范大學(xué)博士科研基金

林 陶(1964—)，博士，副教授，研究方向：植物生態(tài)學(xué)。

S667.9

A

1008-021X(2017)18-0076-04

(本文文獻(xiàn)格式林陶，李婕羚，付遠(yuǎn)洪.無籽刺梨與野生刺梨果實(shí)的氨基酸含量及組成[J].山東化工，2017，46(18)：76-79.)