梁 娟， 吳澤宇， 潘 見， 葛 梅， 徐金鳳

（合肥工業(yè)大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

高壓中溫協(xié)同處理對菠蘿汁活性和致敏性的影響

梁 娟， 吳澤宇， 潘 見*， 葛 梅， 徐金鳳

（合肥工業(yè)大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

為探討高壓協(xié)同中溫對鮮菠蘿汁活性和致敏性的影響，將鮮榨菠蘿汁經不同壓力組合溫度處理后，測定其蛋白質水解活性、纖溶活性和致敏性的變化。結果表明：高壓條件下，溫度對蛋白質水解活性的影響削弱并變得不顯著。400 MPa組合溫度有利于纖溶活性的增加，而500 MPa組合溫度使纖溶活性降低。致敏性則隨著壓力和溫度的增加下降，500 MPa和50℃時致敏性降至51.39%。因此，壓力組合中溫對蛋白質水解活性、纖溶活性和致敏性影響各不相同，選擇合適的溫度和壓力可以同時實現(xiàn)鮮菠蘿汁的?；詈蜏p敏。

超高壓；中溫；菠蘿汁；活性；致敏性

菠蘿（Ananas comosus L.Merr）屬于鳳梨科多年生植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的主要水果品種，我國菠蘿產量居世界第四位[1]。菠蘿中除含有豐富的營養(yǎng)成分，還含有一種蛋白水解酶菠蘿蛋白酶（bromelain，EC 3.4.22.3）[2]。 菠蘿蛋白酶具有抗血小板聚集、溶解纖維蛋白、抗炎、抑制癌細胞生長和轉移及清創(chuàng)等功能等，被廣泛應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[3-6]。除此之外，菠蘿蛋白酶也是一種常見的水果的過敏原，國內學者報道了很多由菠蘿蛋白酶引起的菠蘿過敏的案例，菠蘿過敏尤其容易出現(xiàn)在嬰幼兒以及其他免疫力較弱的人群[7-8]。

菠蘿汁是果汁市場上僅次于橙汁的大宗果汁[9]。傳統(tǒng)的熱殺菌不僅會破壞菠蘿汁的風味和營養(yǎng)，也會完全鈍化菠蘿汁中的主要生物活性成分菠蘿蛋白酶[10-11]。超高壓殺菌可以避免熱殺菌帶來的上述問題，最大程度的保留其風味、營養(yǎng)和菠蘿蛋白酶的活性[12-13]，但同時也部分殘留了致敏性。通過研究高壓協(xié)同中溫處理對菠蘿汁活性和致敏性影響，總結超高壓條件下菠蘿汁活性和致敏性的變化規(guī)律，可以為高活性低致敏性功能菠蘿汁的開發(fā)提供相關的理論與數(shù)據(jù)支持。

商業(yè)菠蘿蛋白酶的活性是通過其對不同底物如酪蛋白、明膠等的蛋白質水解活性來進行表征的。而菠蘿蛋白酶的某些活性如菠蘿蛋白酶抑制癌細胞的生長、轉移及其清創(chuàng)作用主要與纖溶活性有關[5-6]?？寡“寰奂屠w維蛋白溶解也是基于菠蘿蛋白酶的纖溶活性[14-15]。因此本文作者在考察菠蘿汁的致敏性的同時，以超高壓菠蘿汁的酪蛋白水解活性和纖溶活性2個指標來評價菠蘿汁的功能活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 菠蘿：購自合肥市周谷堆農產品批發(fā)市場；低相對分子質量標準蛋白質：購自美國Thermo Fisher公司；牛纖維蛋白原、凝血酶（酶活力62 U/mg）和4-氯-1-萘酚：購自Sigma公司；尿激酶（酶活力1240 U/支）：購自中國食品藥品檢定研究院；福林酚試劑：購自索萊寶科技有限公司；致敏者血清：取自安徽醫(yī)科大學；羊抗人IgE：購于美國Abcam公司；ELISA盒：購于美國Costa公司；PVDF膜：購自美國Pall corporation公司；超濾離心管：購于美國Millipore公司：其余試劑購于上海生工和國藥集團。

1.1.2 儀器 1 L超高壓釜：包頭科發(fā)科技有限公司產品；超高壓系統(tǒng)：上海大隆超高壓設備廠制造；3K15高速冷凍離心機：德國SIGMA公司產品；Thermo TSE320低溫冰箱：美國Thermo公司產品；Epoch微孔板分光光度計：美國BioTek公司產品；DZ-400/2S真空包裝機：浙江金華市包裝機械有限公司產品；SHP-250恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司產品。Epoch微孔板分光光度計：美國BioTek公司產品；JASCO J-810圓二色光譜儀：日本JASCO公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 試樣的處理 選擇新鮮的8成熟的菠蘿，去皮去目，將果肉破碎成小塊榨汁，用6層紗布過濾，除去纖維和其他雜質。然后4 000 r/min于4℃離心30 min去除大分子雜質。保留上清液，棄去沉淀。

用于酪蛋白水解活性和纖溶活性檢測的樣品，取離心的上清液分裝在無菌PE瓶中，PE瓶用密封袋密封，密封袋中充滿水以排除空氣。然后至于1 L的高壓容器中加壓。用于致敏性測定的樣品，取離心后的菠蘿汁緩慢加入硫酸銨粉末提取致敏蛋白質，邊加邊攪拌，直至加到飽和度為40%后停止，繼續(xù)攪拌2 h后，放入離心管中，6 000 r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用雙蒸水復溶，然后用超濾離心管脫鹽和定量復溶，最后調節(jié)pH和添加不同含量的NaCl。所有提取和分離步驟均在4℃條件下進行，處理好的所有樣品于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質水解活性測定 蛋白質水解活性采用Forlin-酚法測定，參照蛋白酶活力測定法商業(yè)標準SB/T10317-1999[16]。蛋白質水解活力計算方法為：每mL菠蘿汁在40℃下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。

式中：A為樣品平行試驗的平均吸光度；4為反應試劑的總體積，mL；10為反應時間10 min；N為稀釋倍數(shù)。

相對蛋白質水解活性如式（2），

式中，M1為待測樣品的蛋白質水解活性；M2為對照品的蛋白質水解活性。

1.2.3 纖溶活性測定 參考Astrup T[17]等采用的纖維素平板法測定菠蘿汁的纖溶活性，并根據(jù)本實驗情況適當改變了凝血酶和纖維蛋白原的比例。以尿激酶為標準品，以尿激酶活力單位數(shù) C（U/mL）的對數(shù)log C為橫坐標，裂解圈的面積 A（mm2）的對數(shù)值log A為縱坐標，繪制標準曲線。測定樣品時取待測樣品10 μL點樣于纖維蛋白平板樣孔中，按上述方法進行操作，測定裂解圈的直徑后取平均值，根據(jù)尿激酶標準曲線求出樣品的纖溶活性。每個樣品做3個平行。

式（3）中，M3為待測樣的纖溶活性；M4為對照樣的纖溶活性。

1.2.4 致敏性測定 采用間接酶聯(lián)免疫法。包被：每孔包被100 μL抗原稀釋液，4℃放置過夜或者37℃保溫2 h。用200 μL PBST洗滌液洗滌3次，每次5 min。封閉：每孔加入封閉液200 μL，37℃孵育2 h，倒出封閉液。加一抗：每孔加入100 μL致敏者血清（1∶200），37 ℃孵育 1 h，洗滌 3 次，每次 5 min。加酶標二抗：每孔加入100 μL辣根過氧化酶標記的羊抗人 IgE（1∶2 000），37 ℃孵育 1 h。 洗滌 5 次，每次5 min。顯色：取出酶標板，每孔加入底物液TBS 200 μL，置于室溫黑暗處放置 15 min。終止：取出酶標板，向每孔中加入終止液50 μL。用酶標儀在450 nm的吸光度下檢測。

1.2.5 不同影響因素的選擇 實驗所用菠蘿汁的天然pH值為pH 3.65，超高壓處理保壓時間均設為20 min，常壓下選擇 10、20、30、40、50、60、70 ℃ 7 個不同溫度，400 MPa和500 MPa壓力條件下10、20、30、40、50℃ 5個溫度。每個實驗平行測定 3次，以未經超高壓處理菠蘿汁的蛋白質水解活性、纖溶活性和致敏性作為參照，相對值定義為100%?？疾斐邏航M合溫度對菠蘿汁的蛋白質水解活性，纖溶活性和致敏性的影響時，選擇溫度范圍是10～50℃，主要是考慮到溫度高于50℃時，會影響菠蘿汁的風味和香氣成分[18-19]。超高壓選擇400 MPa和500MPa的主要原因是2個，首先超高壓用于果汁殺菌一般選擇400 MPa或者以上，其次根據(jù)之前的研究結果，400 MPa壓力以上時，菠蘿汁活性和致敏性的差異較大且致敏性下降速度較快，有利于同時實現(xiàn)菠蘿汁的?；詈蜏p敏。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用EXCEL2007和Designexpert 8.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 高壓中溫協(xié)同對蛋白質水解活性的影響

根據(jù)蛋白質水解活性標準曲線，菠蘿汁原樣的蛋白質水解活性為（74.67±2.66）U/mL，其相對值定義為100%。圖1顯示了常壓、400 MPa和500 MPa的壓力下不同溫度對蛋白質水解活性的影響。從該圖可以看出，常壓下，相對蛋白質水解活性隨溫度的升高先增加后降低，并于50℃時達到最大值112.59%。這與文獻報道的菠蘿蛋白酶的最適酶活為55℃基本一致[20]。當溫度高于酶的最適溫度范圍時，溫度升高，酶蛋白的氫鍵、疏水作用、離子鍵和靜電相互作用會弱化，三維構象受到破壞，酶出現(xiàn)熱失活，使得酶活力降低甚至完全鈍化。常壓下，溫度對蛋白質水解活性的影響顯著（p＜0.05）。

圖1 壓力協(xié)同不同溫度對蛋白質水解活性的影響Fig.1 Effects of high pressure combined with temperature on proteolytic activity of pineapple juice

400 MPa，10～50℃時，蛋白質水解活性變化不明顯，500 MPa，10～50 ℃，蛋白質水解活性隨壓力的略有降低。另外，高壓條件下溫度較低時（如10℃），高壓能夠增加菠蘿蛋白酶的活性。這與Sun等[21]認為從的在一定溫度范圍內，溫度恒定時提高壓力將導致分子有序性的形成相符合。

數(shù)據(jù)分析顯示壓力組合中溫對蛋白質水解活性的影響不顯著（p＞0.05）且壓力和溫度之間存在交互作用（p＜0.05）。 Fang[22]等研究高壓協(xié)同中溫對過氧化物酶活力的影響時也發(fā)現(xiàn)了類似的結果。以上分析說明超高壓減弱了溫度對蛋白質水解活性的影響，使得二者的組合效應對蛋白質水解活性的影響不明顯不顯著。

2.2 高壓中溫協(xié)同對纖溶活性的影響

根據(jù)纖溶活性標準曲線，菠蘿汁原樣纖溶活性為（247.88±13.21）U/mL，其相對值定義為 100%。從圖2可以看出常壓下，菠蘿汁的相對纖溶活性和相對蛋白質水解活性曲線的變化趨勢相似，這和Morita[23]等認為的菠蘿蛋白酶纖溶活性和蛋白水解活性有關的研究結果相似；但溫度對二者的影響程度不同，纖溶活性受溫度的影響更大，50℃時相對纖溶活性達到最高值121.33%。常壓下，溫度對菠蘿汁纖溶活性的影響顯著（p＜0.05）。

圖2 壓力協(xié)同不同溫度對纖溶活性的影響Fig.2 Effects of high pressure combined with temperature on fibrinolytic activity of pineapple juice

超高壓組合溫度對纖溶活性的影響則不同于對蛋白水解活性的影響。400 MPa、20～50℃條件下，纖溶活性幾乎是無差別的；500 MPa、10～40℃之間纖溶活性隨著溫度上升而上升，50℃時略有下降。400 MPa組合溫度有利于纖溶活性的增加，而500 MPa組合溫度使得纖溶活性低于常壓下的值。50℃，400 MPa和500 MPa條件下的纖溶活性分別為118.63%和84.57%。400 MPa時纖溶活性增強，可能是由于該壓力促使菠蘿蛋白酶的結構微調，從而形成更有利于酶與其纖溶活性底物相結合的構型。而更高的壓力（如500 MPa）則會破壞菠蘿蛋白酶的高級結構，從而使酶的活性降低。張瑜[24]等通過對脂肪酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，壓力和溫度對酶分子排列和空間構象存在拮抗關系，認為不同加工條件下，加壓或升溫對酶的影響不同。低溫低壓，適度地增加溫度和壓力都能使酶保持其穩(wěn)定性；高溫高壓，溫度和壓力任一增加都會破壞酶的穩(wěn)定；低溫高壓，增加壓力使酶變性，增加溫度能夠穩(wěn)定酶活，高溫低壓作用相反。Eisenmenger等[25]報道了具有類似變化曲線的食品酶還有胰凝乳蛋白酶、多酚氧化酶、果膠甲酯酶、柚苷酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶等。數(shù)據(jù)分析顯示超高壓組合溫度對纖溶活性的影響顯著（p＜0.05）且壓力和溫度對纖溶活性的影響具有交互作用（p＜0.05）。

2.3 高壓中溫協(xié)同對致敏性的影響

根據(jù)致敏性檢測方法標準曲線，菠蘿汁原樣的致敏原質量濃度為（0.955±0.043）mg/mL，相對值定義為100%。從圖3可以看出常壓下，與蛋白質水解活性和纖溶活性在50℃時最高不同，致敏性在20℃時達到最大值。常壓下溫度對致敏性的影響顯著（p＜0.05）。

圖3 壓力協(xié)同不同溫度對致敏性性的影響Fig.3 Effects of high pressure combined with temperature on allergenicity of pineapple juice

不同壓力組合溫度使得致敏性均低于常壓下的值，但400 MPa時，致敏性曲線變化較平緩，500 MPa時隨著溫度增加的致敏性下降速率加快，500 MPa和50℃時，相對致敏性降至51.39%。說明在較高溫度和較高壓力時有利于致敏性的降低。數(shù)據(jù)分析顯示常壓下溫度對致敏性的影響顯著 （p＜0.05）。400 MPa時溫度對致敏性影響不顯著（p＞0.05），500 MPa時溫度對致敏性影響顯著（p＜0.05），壓力組合溫度對致敏性的影響具有交互作用（p＜0.05）。

比較圖1—圖3可以看出，超高壓條件下，溫度對蛋白質水解活性和致敏性的影響相似，這和Hale等[26]等發(fā)現(xiàn)的菠蘿蛋白酶和其他半胱氨酸蛋白酶的蛋白質水解活性和致敏性有一定的關系，并發(fā)現(xiàn)鈍化菠蘿蛋白酶可以降低其致敏性的研究結果相似。但超高壓對致敏性的影響程度更大。500 MPa時，蛋白質水解活性和致敏性均隨著溫度的升高而降低，致敏性下降速率更快；在500 MPa、50℃時蛋白質水解活性降至75.10%，而致敏性則降至51.39%。超高壓組合中溫對纖溶活性的影響則不同，400 MPa組合中溫可以提高纖溶活性，500 MPa組合中溫則使纖溶活性降低。

引起菠蘿蛋白酶蛋白水解活性、纖溶活性和致敏性變化的均是菠蘿蛋白酶，但是壓力組合中溫對三者的影響的不同。這可能是由于菠蘿蛋白酶對三者的作用機制不同。蛋白質水解活性的作用目標物是酪蛋白，纖溶活性是同時直接降解纖溶蛋白和把血纖維蛋白溶酶原轉化成溶纖維蛋白酵素來降解纖維蛋白[27]。而菠蘿蛋白酶的致敏性則是由抗原表位決定的，但關于菠蘿蛋白酶致敏性的抗原表位和作用機制的研究目前并未見相關報道。除此之外，菠蘿蛋白酶的活性位點和抗原表位也可能受到基質組成的影響而表現(xiàn)出各自的變化特征。方亮[28]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃汁中的過氧化物酶在不同緩沖溶液和真實的食品體系中表現(xiàn)出不同的活性，Basak[29]和Rastogi[30]認為由于不同的食品具有不同的pH值和化學組成成分，同種酶自不同食品基質中所表現(xiàn)的耐壓特性有不同。對于本研究來說，我們主要是考察超高壓菠蘿汁的特性，而非單純的菠蘿蛋白酶溶液，超高壓菠蘿汁是一個具有復雜基質的體系。

3 結 語

常壓下溫度對蛋白質水解活性影響顯著，50℃時蛋白質水解活性達到最大值；超高壓能減弱溫度對蛋白質水解活性的影響，使高壓下條件溫度對蛋白質水解活性的影響不顯著，400 MPa時，蛋白質水解活性幾乎無變化，500 MPa時，蛋白質水解活性隨溫度的增加略有降低。

常壓下菠蘿汁的纖溶活性和蛋白質水解活性的變化趨勢相似，但溫度對纖溶活性的影響程度更大。400 MPa、20～50℃時，纖溶活性幾乎是無差別的；500 MPa、10～40℃之間纖溶活性隨著溫度上升而上升，50℃時略有下降。且400 MPa組合溫度有利于纖溶活性的增加，而500 MPa組合溫度則使纖溶活性降低。50℃、400 MPa和500 MPa條件下的纖溶活性分別為118.63%和84.57%。

常壓下致敏性于20℃時達到最大值；高壓條件下，隨著壓力和加壓溫度的增加致敏性逐漸下降，500 MPa、50℃時降至 51.39%。

綜上，壓力組合中溫對蛋白質水解活性、纖溶活性和致敏性影響各不相同，選擇合適的溫度和壓力可以同時實現(xiàn)鮮菠蘿汁的?；詈蜏p敏。

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Effect of Combined High Pressure and Thermal Treatment on Activities and Allergenicity of Pineapple Juice

LIANG Juan， WU Zeyu， PAN Jian*， GE Mei， XU Jinfeng
（Engineering Research Centre of Bio-Process，Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

In order to investigate the effect of high pressure combined with moderate temperature on the activity and allergenicity of pineapple juice，after treated by different pressures and temperatures，the proteolytic activity，fibrinolytic activity and allergenicity change of fresh squeezed pineapple juices were detected.The results showed that the effect of temperature on proteolytic activities were weaken and not significant under high pressure.The fibrinolytic activities increased under 400 MPa treatment combined with different temperatures，while decreased under 500 MPa treatment combined with a series of temperatures.Allergenicity decreased with the increase of pressure and temperature，and fell to 51.39%at 500 MPa and 50 ℃ .Therefore，the effect of high pressure combined with moderate temperature on proteolytic activity，fibrinolytic activity and allergenicity was different.Preserving activity and reducing allergenicity of pineapple juice could be achieved simultaneously with the selection of appropriate temperature and pressure.

ultra-high pressure，moderate temperature，pineapple juice，activity，allergenicity

TS 255.1

A

1673—1689（2017）08—0849—06

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.010

2015-06-11

安徽省自然科學基金項目（1708085QC77）。

*通信作者：潘 見（1955—），男，安徽合肥人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事功能食品研究。E-mail：hfut20022013@sina.com

梁娟，吳澤宇，潘見，等.高壓中溫協(xié)同處理對菠蘿汁活性和致敏性的影響[J].食品與生物技術學報，2017，36（08）：849-854.