曹玉瑤,王維維，周宣羽,劉紅艷,丁青根，單玲玲

宿州學院生物與食品工程學院，生物技術藥物研究所，宿州，234000

2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇兩性小分子單體的制備與表征

曹玉瑤,王維維，周宣羽,劉紅艷,丁青根，單玲玲*

宿州學院生物與食品工程學院，生物技術藥物研究所，宿州，234000

在前期研究的基礎上，選用已制備的2-氨基葡萄糖和熒光染料(2DA-FITC )作為“導向基團”靶向高表達葡萄糖轉運受體GLUT1的腫瘤細胞和組織，并將其作為兩性小分子的親水端，共價偶聯紫杉醇-谷氨酸(PTX-Glu)作為兩性小分子疏水端，合成同時具有親水性和疏水性的2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)兩性小分子單體，并用LC-MS和核磁共振氫譜1H-NMR對2DA-FITC-PTX進行結構表征。實驗結果證明已成功制備2DA-FITC-PTX兩性小分子單體。

兩性小分子；2-氨基葡萄糖； 紫杉醇

目前，臨床上廣泛使用的小分子和高分子藥物都存在以下缺點：(1)小分子藥物通過口服或注射給藥，短時間內體內藥物濃度遠超過實際需求量，且無選擇性；新陳代謝快、半衰期短、體內濃度很快降低而影響療效，故需要大劑量給藥，而過高的藥物濃度又會增強藥物的副作用[1]；(2)生物高分子藥物在體內易被酶降解或失活，生物半衰期短， 需重復給藥；還受到如免疫系統(tǒng)、組織、細胞膜等的限制，多數不易通過這些生物屏障，因而高分子藥物的生物利用度較低[2]。因此，如何提高化學藥物的局部濃度，減少全身毒副反應，一直是學界研究的熱門課題。

近年來，國內外學者對難溶性化學藥物劑型的研究取得一些進展，其中將難溶性化學藥物構建成腫瘤靶向性納米粒子載藥系統(tǒng)是重要方法之一。用于藥物輸送的納米粒子材料主要是高分子聚合物，載有藥物的聚合物納米粒子通常以膠體分散體的形式通過口服或經皮、皮下和肌肉注射，動脈注射，靜脈點滴以及體腔黏膜吸附等給藥途徑進入人體[3-4]，但高分子聚合物由于分子量較大，在體內很難分散成單體形式給藥[5-6]。因此，學界嘗試制備結構規(guī)整的兩性腫瘤靶向性小分子，在體內釋放靶向性小分子作用于腫瘤組織。

本文在前期研究的基礎上，將已制備的2-氨基葡萄糖-熒光染料(2DA-FITC)作為兩性小分子單體的親水端，共價偶聯谷氨酸-紫杉醇前藥中間體，并將其作為兩性小分子單體的疏水端，合成兩性小分子單體2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇前藥，采用LC-MS和1H-NMR對結構進行表征。

1 試劑與方法

1.1 實驗試劑

2-氨基葡萄糖由實驗室制備，紫杉醇(PTX)、谷氨酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]、熒光染料FITC均購買于sigma公司，二氯甲烷(DCM)和4-二甲氨基必定(DMAP)為AR級，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

核磁共振1H-NMR和質譜LC-MS檢測儀器由中國藥科大學生物醫(yī)學工程研究室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 谷氨酸-紫杉醇(Glu-PTX)的合成

稱取100 mg(0.117 mmoL)PTX溶于15 mL的DCM，同時加入59.7 mg (0.1404 mmol，1.2 eqv)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和14.29 mg DMAP(0.117mmoL)，將44.85 mg(0.234mmoL,2eqv)EDC溶于10 mL DCM中，在冰浴條件下，將10 mL溶于EDC溶液，并緩慢滴入到PTX反應體系中，大約25 min滴加完畢，除去冰浴，室溫下攪拌26 h，用TLC示蹤。待反應完后，用同體積的DCM稀釋，然后用同體積的蒸餾水洗2次，加入無水硫酸鎂干燥，真空旋蒸后得晶狀體產物谷氨酸-紫杉醇，其結構用LC-MS進行分子量鑒定。

1.3.2 2-氨基葡萄糖-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Glu(OtBu)-PTX)中間體的制備

將產物Fmoc-Glu(OtBu)-PTX中溶于8 mL DCM，并加入100 μL，在室溫下攪拌過夜，直至出現渾濁，然后用TLC示蹤。將產物再次真空旋蒸除去溶劑，再用乙醚萃取(OtBu溶于乙醚中)，放入冰箱過夜，將乙醚去除，烘干產物，即得脫去了OtBu的Fmoc-Glu(COOH)-PTX白色晶體。將0.01 mmol Fmoc-Glu(COOH)-PTX溶于DMF中，加入EDC和NHS(摩爾比1∶1.2∶2)活化Fmoc-Glu(COOH)-PTX的羧基，室溫攪拌4 h后，加入0.01 mmoL 2DA，室溫下攪拌過夜，將反應液經硅膠柱純化，得到純化的2-氨基-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Fmoc-Glu-PTX)，將2DA-Fmoc-Glu-PTX溶于DCM體系中，再加入2 mL哌啶(使哌啶為總體積的20%)，用乙醚萃取，用TLC示蹤，得到2DA-NH2-Glu-PTX前藥，并鑒定其化學結構。

1.3.3 2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)兩性小分子單體的制備

將0.1 mmoL 2DA-NH2-Glu-PTX前藥中加入7 mL DCM溶解后，加入0.1 mmoL熒光染料FITC，室溫下攪拌過夜，將反應液經G15純化，去除沒有共價偶聯的2DA-NH2-Glu-PTX和FITC片段，得到純化的2氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥(2DA-NH2-Glu-PTX-FITC)小分子單體，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 靶向性紫杉醇前藥單體及中間體的表征

用核磁共振氫譜1H和LC-MS對靶向性紫杉醇藥前藥中間體和單體進行化學結構鑒定。

2 結果與討論

2.1 谷氨酸-紫杉醇中間體(Glu-PTX)結構鑒定

純化后的NH2-Glu(OtBu)-PTX用LC-MS分析，其質譜鑒定的結果與NH2-Glu(OtBu)-PTX的理論分子完全一致，NH2-Glu(OtBu)-PTX:MS (ESI,m/z): 1283.4([M+H]+) ，如圖1。證明已成功合成谷氨酸-紫杉醇中間體。

圖1 LC-MS鑒定谷氨酸-紫杉醇中間體的分子量 NH2-Glu(OtBu)-PTX: MS (ESI, m/z): 1283.4([M+H]+)

2.2 2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)前藥結構鑒定

用LC-MS對2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)分子量進行鑒定，結果顯示其質譜鑒定的結果與2DA-PTX前藥理論上分子量完全一致，2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68([M+H]+)，如圖2。由此可證明2DA-PTX前藥已成功地合成。

圖2 LC-MS鑒定2-氨基葡萄糖-紫杉醇分子量 2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68 ([M+H]+)

2.3 兩性小分子2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇(2DA-FITC-PTX )單體結構鑒定

用核磁共振氫譜1H鑒定2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥單體結構，從氫譜圖可以看出親水端與疏水端共價偶聯2-OH位置在4.77 ppm到5.44 ppm之間(圖3)，證明小分子單體的合成。

圖3 核磁氫譜鑒定小分子2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥單體

3 結 論

在傳統(tǒng)抗腫瘤藥物劑型中，存在包封率低、易滲漏、穩(wěn)定性差、毒副作用大和靶向性差等問題[7]。兩性小分子自組裝靶向性納米粒子載藥系統(tǒng)，在高效率載藥的同時，在酸性條件下也可生物降解成小分子靶向性前藥釋放紫杉醇原藥。納米粒子藥物除具有低毒、高效、緩釋、長效，能識別變異細胞，藥物穩(wěn)定性好，藥物釋放后的高分子載體無毒，不會長期積累在體內，以及副作用小等優(yōu)點外[8], 還具有更強的定向釋放能力, 是各種藥物的較佳替代品。本文在前期研究的基礎上，用2-氨基葡萄糖-熒光染料(2-DA-FITC)作為兩性小分子單體的“導向基團”和親水端，共價偶聯谷氨酸-紫杉醇[(2DA-Glu(OtBu)-PTX]中間體作為兩性小分子單體的疏水端，制備兩性小分子單體2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇前藥(2DA-FITC-PTX)，旨在為進一步構建靶向性納米藥物傳遞體系提供實驗依據。

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(責任編輯：汪材印)

TP273

A

1673-2006(2017)09-0115-03

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.09.027

2017-07-05

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510379027，201410379014)；安徽省教育廳自然科學研究重點項目(KJ2014A249)；宿州學院科研平臺開放課題(2016ykf08)。

曹玉瑤(1995-)，女，安徽宿州人，研究方向：腫瘤靶向性藥物的合成與應用。

*通信作者：單玲玲(1971-)，女，安徽宿州人，博士，副教授，研究方向：抗腫瘤藥物及其新劑型。