木 魁，姜 楠，尚夢婷，溫海燕，姜雙林

阜陽師范學(xué)院 1.生命科學(xué)學(xué)院，2.胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點實驗室，阜陽,236037

碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物對小鼠肺部損傷作用機(jī)理

木 魁1,2，姜 楠1,2，尚夢婷1,2，溫海燕1,2，姜雙林1,2

阜陽師范學(xué)院 1.生命科學(xué)學(xué)院，2.胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點實驗室，阜陽,236037

目的評估大氣中碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物對活體動物肺部的損傷作用，從氧化應(yīng)激和炎癥損傷兩個方面探討毒性機(jī)理。方法將30只6周齡雌性昆明白小鼠體重為(25.0±1.3)g，隨機(jī)分成3組，每組10只。碳黑和碳黑與鉛的復(fù)合物(硝酸鉛∶碳黑為1∶250)用磷酸鹽緩沖液制成懸液對小鼠進(jìn)行氣管滴注，劑量為4 mg·kg-1小鼠體重，滴注量為50 μL，空白組用磷酸鹽緩沖液處理，染毒1次，72 h后處死小鼠。對小鼠肺部進(jìn)行病理學(xué)切片，并檢測肺灌洗液生理生化指標(biāo)，測得乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量，炎癥指標(biāo)的白細(xì)胞介素-8 (IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，以及肺部酶活力超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、 酸性磷酸酶(ACP)活性。結(jié)果通過對病理學(xué)觀察分析，染毒組肺部出現(xiàn)炎癥損傷。染毒組LDH和MDA均顯著高于對照組(P<0.01)；IL-8含量高于對照組(P<0.05)；TNF-α含量顯著高于對照組(P<0.05)；染毒組酶活力(SOD、AKP、ACP)也均高于對照組。結(jié)論小鼠肺部在短期高劑量的碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物暴露下，引起急性炎癥損傷，黑碳與鉛復(fù)合物毒性高于黑碳。

碳黑；小鼠；作用機(jī)理

1 相關(guān)研究與問題提出

我國黑碳顆粒的排放約占全球的四分之一，中國大陸黑碳排放總量約達(dá)到181×104t[1-2]。黑碳顆粒是PM2.5的主要組分之一，也是PM2.5傳輸和吸附有毒有害物質(zhì)的載體，能誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3]。碳黑因孔隙發(fā)達(dá),粒徑小，比表面積大，具有極強的吸附重金屬離子(如Pb、Cd、Zn、Mn、Cr等)能力。碳黑吸附重金屬離子后，形成黑碳-污染物復(fù)合體[4]。

空氣中的鉛主要來源于燃油和燃煤排放，它與空氣中的黑碳結(jié)合，形成二次黑碳粒子，即黑碳與鉛的復(fù)合物。Liu等人研究發(fā)現(xiàn)，黑碳(一次性黑碳)暴露于O3后制備的二次黑碳(黑碳-臭氧復(fù)合體)的氧化損傷和細(xì)胞毒性效應(yīng)明顯增強[5]。Renwick等采用黑碳制成懸液對大鼠做氣管滴注，經(jīng)LDH法研究顆粒物對肺泡巨噬細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示黑碳對肺泡巨噬細(xì)胞有明顯的毒性作用，隨著濃度的升高，各組肺泡巨噬細(xì)胞吞噬熒光膠珠的熒光強度明顯降低，提示肺泡巨噬細(xì)胞在吸入顆粒物后的吞噬功能逐漸降低，并且相對于PM2.5，黑碳對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能的損傷更大[6]。Diabaté等研究了黑碳標(biāo)準(zhǔn)品、粉煤灰及其不同組分誘發(fā)人肺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)粉煤灰的不溶性過渡金屬組分Pb、Zn、Fe能誘導(dǎo)ROS和tGSH的含量升高，并誘導(dǎo)產(chǎn)生了HO-1、Nrf2以及IL-6、IL-8、COX-2、TNF-α等細(xì)胞因子基因的高表達(dá)；而黑碳也能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，但不能誘導(dǎo)產(chǎn)生HO-1[7]。

本實驗采用商品化碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物對昆明白小鼠進(jìn)行氣管滴注染毒，摘取小鼠肺部進(jìn)行病理學(xué)分析和肺灌洗液生理生化指標(biāo)的檢測，探討碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物誘發(fā)肺部氧化損傷、炎癥反應(yīng)和代謝酶活性，為揭示碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物對生物健康安全效應(yīng)研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 主要試劑

總蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)測試盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒為IBL International產(chǎn)品，Multiskan GO型酶標(biāo)儀為美國Thermo公司產(chǎn)品 。

2.2 碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物懸液制備

本實驗使用的碳黑為商品化碳黑C824455(麥克林)，碳黑與鉛的復(fù)合物在常溫下與硝酸鉛標(biāo)準(zhǔn)液中混合，80℃水浴加熱攪拌至碳黑懸浮于溶液中，蒸干至恒重，然后轉(zhuǎn)到坩堝再在馬弗爐中300℃加熱3 h制備成硝酸鉛與碳黑比例為1∶250的樣品。經(jīng)過與硝酸鉛復(fù)合的碳黑能穩(wěn)定結(jié)合，粒徑有所增加。用磷酸鹽緩沖液配置碳黑和碳黑與鉛的復(fù)合物的1 mg·mL-1濃儲液，超聲30 min后備用。

2.3 動物分組與暴露

30只健康清潔級昆明白小鼠6周齡雌鼠，體重為(25.0±1.3)g，購入后適應(yīng)性飼喂1周，小鼠自由飲水取食，隨機(jī)分成3組，每組10只。碳黑和碳黑與鉛的復(fù)合物(硝酸鉛∶碳黑為1∶250)用磷酸鹽緩沖液制成懸液對小鼠進(jìn)行氣管滴注，劑量為4 mg·kg-1體重，滴注量為50 μL，空白組用磷酸鹽緩沖液處理，染毒1次，72 h后處死小鼠，摘取小鼠肺部。

氣管滴注方法[8]：配置1%戊巴比妥鈉，按照3 mL·kg-1體重麻醉小鼠，在靜脈留置針去針頭的PVC軟管內(nèi)橫向注入50 μL含顆粒物的液體，將PVC軟管插入小鼠聲門裂，當(dāng)小鼠呼吸與留置針內(nèi)液體波動一致即可，隨后將含顆粒物液體打入氣道。

2.4 病理學(xué)檢查和生理生化指標(biāo)檢測

2.4.1 小鼠右肺組織病理學(xué)切片

摘取小鼠右肺，經(jīng)過固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟，制成石蠟切片進(jìn)行病理學(xué)檢查。

2.4.2 小鼠左肺灌洗液指標(biāo)檢測

用冷PBS反復(fù)灌洗小鼠左肺，肺灌洗液經(jīng)過低溫離心機(jī)4 400 r/min離心10 min，對上清液測定總蛋白(BCA法)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-8 (IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

2.5 統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件分析，P<0.05表明具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著性差異。

3 結(jié) 果

小鼠在實驗過程中自由飲水取食，未發(fā)現(xiàn)異常，體重變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義，期間無中毒跡象，無死亡。

3.1 肺組織切片觀察

電鏡觀察對照組PBS滴注的小鼠肺組織切片，結(jié)果顯示肺泡均勻、大小正常，肺泡壁薄而光滑，肺泡腔無滲出異物，間隔均勻。碳黑處理組可見肺組織出現(xiàn)炎性改變，肺泡間隔，不均勻，肺泡壁增厚，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔變小，氣腔變大。碳黑與鉛的復(fù)合物處理組肺組織炎性更嚴(yán)重，肺泡結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，肺泡壁增厚，肺泡腔變小，氣管腔進(jìn)一步變大，炎細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，血管內(nèi)淤血。

圖1 小鼠肺部病理圖片( HE×100)

3.2 氧化損傷指標(biāo)

圖2 不同材料肺灌洗液LDH活性

圖3 不同材料肺灌洗液MDA含量

如圖2，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組中LDH活性水平均顯著高于空白對照組(P<0.01)，碳黑與鉛復(fù)合物處理組中LDH活性水平高于其他兩組(P<0.05)。如圖3，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組中MDA含量均顯著高于空白對照(P<0.01)，碳黑處理組比對照組MDA含量升高1.8倍，碳黑與鉛復(fù)合物處理組比對照組MDA含量升高1.9倍。各組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

3.3 炎癥損傷指標(biāo)

如圖4，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組中IL-8含量均高于對照組(P<0.05)，碳黑處理組比對照組MDA含量升高了11.91%，碳黑與鉛復(fù)合物處理組比對照組MDA含量升高了52.32%。如圖5，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組中TNF-α含量均高于對照組(P<0.01)，碳黑處理組比對照組TNF-α含量升高了35.42%，碳黑與鉛復(fù)合物處理組比對照組TNF-α含量升高了36.93%。各組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖4 不同材料肺灌洗液IL-8含量

圖5 不同材料肺灌洗液TNF-α含量

3.4 肺組織代謝酶活性

圖6 不同材料肺灌洗液SOD活性

如圖6，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組中SOD含量均高于對照組(P<0.01)，碳黑處理組比對照組SOD活性升高了14.89倍，碳黑與鉛復(fù)合物處理組比對照組SOD活性升高了30.61倍。如圖7，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組中AKP活性均高于對照組，碳黑處理組比對照組AKP活性升高了1.69倍，碳黑與鉛復(fù)合物處理組比對照組AKP含量升高2倍，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。如圖8，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組中ACP活性均高于對照組，碳黑處理組比對照組ACP活性升高了1.23倍，碳黑與鉛復(fù)合物處理組比對照組ACP含量升高了2.01倍,各組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

圖7 不同材料肺灌洗液AKP活性

圖8 不同材料肺灌洗液ACP 活性

4 討 論

4.1 氧化損傷方面

正常情況下,體內(nèi)氧化和抗氧化處于動態(tài)平衡狀態(tài)，碳黑處理組和碳黑與鉛復(fù)合物處理組能引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜受損或通透性增加時可漏至細(xì)胞外,導(dǎo)致細(xì)胞外液中LDH 的活性增加[9]。LDH活性的高低能反映膜損傷程度。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度。結(jié)果表明，碳黑與鉛復(fù)合物處理組比碳黑處理組產(chǎn)生的LDH和MDA的水平更高?？梢?碳黑與鉛復(fù)合物處理組和碳黑處理組均能引起肺部組織細(xì)胞膜損傷和脂質(zhì)過氧化，且碳黑與鉛復(fù)合物處理組的損傷更嚴(yán)重。

4.2 炎癥損傷方面

機(jī)體遭到外源物質(zhì)入侵可激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生單核細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、G-CSF和M-CSF等)，募集免疫細(xì)胞保護(hù)機(jī)體，但過量的單核細(xì)胞因子對機(jī)體有害[10]。

白細(xì)胞介素-8(IL-8)又稱嗜中性粒細(xì)胞因子，是炎癥性疾病的重要介質(zhì)，在抗感染、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)以及抗腫瘤方面有重要作用，可以通過IL-8水平反映肺組織產(chǎn)生炎癥的程度。腫瘤壞死因子TNF-α是一種單核細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是具有重要生物學(xué)活性的炎性介質(zhì)，同樣可以通過TNF-α水平反映肺組織炎癥反應(yīng)程度。實驗結(jié)果表明，碳黑與鉛復(fù)合物處理組和碳黑處理組的肺組織內(nèi)IL-8和TNF-α水平都顯著高于對照組(P<0.05)，碳黑與鉛復(fù)合物處理組均高于碳黑處理組，肺組織釋放大量的IL-8和TNF-a,導(dǎo)致肺部受損。因此,碳黑與鉛復(fù)合物處理組和碳黑處理組均能引起肺部組織炎癥損傷，且碳黑與鉛復(fù)合物處理組引起的肺組織炎癥損傷更嚴(yán)重。

4.3 肺組織代謝酶活性

SOD是一種重要的抗氧化酶,能夠清除機(jī)體超氧陰離子自由基，在防御機(jī)體衰老和DNA 損傷以及保護(hù)細(xì)胞等方面發(fā)揮重要作用[11]。細(xì)胞受到損傷時，SOD出現(xiàn)應(yīng)激性升高。酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)是兩種重要的機(jī)體功能調(diào)節(jié)酶。酸性磷酸酶廣泛分布于生物界，是一種磷酸酯酶，大量研究表明磷酸酶活力是細(xì)胞和體液免疫的綜合體現(xiàn)，也是衡量免疫功能和機(jī)體狀態(tài)的指標(biāo)，反映機(jī)體對外源物侵染的防御能力。在動物實驗方面證明，肺組織細(xì)胞破損后，細(xì)胞外SOD、ACP和AKP均顯著升高[11]。

當(dāng)小鼠被黑碳及黑碳與鉛復(fù)合物染毒后，體內(nèi)酸、堿性磷酸酶的活性會受到不同程度的影響。肺部產(chǎn)生炎癥時，SOD、ACP和AKP含量均升高，且黑碳-鉛復(fù)合物比黑碳的影響更加顯著。因此，碳黑與鉛復(fù)合物處理組和碳黑處理組均能引起肺部組織損傷，且碳黑與鉛復(fù)合物處理組引起的肺組織損傷更嚴(yán)重。

綜上所述，碳黑和碳黑與鉛復(fù)合物均能引起小鼠肺部組織損傷，主要包括氧化損傷和炎癥損傷兩個方面，且碳黑與鉛復(fù)合物對肺部損傷比純碳黑更嚴(yán)重，但有關(guān)損傷機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

[1]Streets D G,Gupta S,Waldhoff S T,et al.Black carbon emissions in China Atmos[J].Environ,2001,35:4281-4296

[2]Menon S,Hansen J,Nazarenko L,et al.Climate effects of black carbon aerosols in China and India[J].Science,2000,297:2250-2253

[3]Dockery DW,Pope CA,Xu X.An association between air pollution and mortality in six US cities[J].N Engl J Med,2003,329:1753-1759

[4]Pope CA,Hansen ML.Ambient particulate air pollution,heart rate variability,and blood markers of inflammation in a panel of elderly subjects[J].Environ Health Persp,2004,112:339-345

[5]Liu Y,Liu C,Ma Q,et al.Structural and hygroscopic changes of soot during heterogeneous reaction with O3[J].Phys Chem Chem Phys,2010,12:10896-10903

[6]Renwick L C,Brown D,Clouter A,et al.Increased inflammation and altered macrophage chemotactic responses caused by two ultrafine particle types[J].Occup Environ Med,2014,81:442-447

[7]Diabaté S,Britta B B,Plaumann D,et al.Anti-oxidative and inflammatory responses induced by fly ash particles and carbon black in lung epithelial cells[J].Anal Bioanal Chem,2011,401:3197-3212

[8]賈曉峰,郭新彪.改進(jìn)型快速小鼠氣管滴注法:透射燈下經(jīng)口直視滴注法研究[J].環(huán)境與健康雜志,2012(3):217-219

[9]劉芳,楊翠軍,李志軍,等.小鼠實驗性缺氧腦和肺組織MDA、LD含量和LDH活性變化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(4):2044-2045

[10]李容漢,李瓊珍,鄧群娣,等.兒童支原體肺炎血清中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10濃度臨床研究的意義[J].中國婦幼衛(wèi)生雜志,2014(5):32-35

[11]Mendola P,Wallace M,Liu D,Robledo C,et al.Air pollution exposure and preeclampsia among us women with and without asthma[J].Environ Res，2016，148:248-255

(責(zé)任編輯：汪材印)

R114

A

1673-2006(2017)09-0111-04

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.09.026

2017-05-26

國家自然科學(xué)基金重大研究計劃項目“黑炭和黑炭-污染物復(fù)合體誘發(fā)肺部炎癥反應(yīng)的作用機(jī)理研究”(91643113)。

木魁(1990-)，安徽亳州人，在讀碩士研究生，研究方向：環(huán)境毒理學(xué)。