何承彥 孫毅 高露娟 李明 曾同祥

434100湖北荊州，長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院皮膚科（何承彥、孫毅、曾同祥）；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科（高露娟、李明）

伊曲康唑、特比萘芬和他克莫司單用及聯(lián)合對(duì)皮炎外瓶霉的體外抗真菌作用

何承彥 孫毅 高露娟 李明 曾同祥

434100湖北荊州，長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院皮膚科（何承彥、孫毅、曾同祥）；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科（高露娟、李明）

目的探討他克莫司與伊曲康唑、特比萘芬聯(lián)合對(duì)皮炎外瓶霉的體外抗真菌效果。方法參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所M38?A2方案，測(cè)定特比萘芬和伊曲康唑?qū)?2株皮炎外瓶霉的最低抑菌濃度；利用棋盤法，測(cè)定他克莫司和伊曲康唑或特比萘芬的聯(lián)合抗皮炎外瓶霉效果。結(jié)果特比萘芬和伊曲康唑?qū)ζぱ淄馄棵棺畹鸵志鷿舛确秶謩e為（0.06～0.125）mg/L和（0.5～1）mg/L。他克莫司和特比萘芬聯(lián)合對(duì)5株皮炎外瓶霉、他克莫司和伊曲康唑聯(lián)合對(duì)10株皮炎外瓶霉有協(xié)同作用。兩組均無拮抗作用。結(jié)論他克莫司在體外與伊曲康唑或特比萘芬聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能夠增加皮炎外瓶霉對(duì)伊曲康唑和特比萘芬的敏感性。

伊曲康唑；藥物協(xié)同作用；體外研究；皮炎外瓶霉；他克莫司；特比萘芬

皮炎外瓶霉是暗色絲孢霉病的主要致病菌之一［1］。它不僅可以引起皮膚、皮下組織感染，還可以引起播散性感染，其中神經(jīng)系統(tǒng)感染多見，死亡率高達(dá)90%［2?3］。特比萘芬和伊曲康唑是治療皮膚及皮下組織真菌感染最常用的系統(tǒng)性抗真菌藥物，但對(duì)暗色絲孢霉病的療效較差［3?5］。他克莫司是一種鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，多項(xiàng)研究已證實(shí)，他克莫司和抗真菌藥物聯(lián)合對(duì)煙曲霉、念珠菌、皮膚癬菌、毛霉等多種致病性真菌具有協(xié)同效應(yīng)［6?9］。為了開發(fā)新型抗真菌聯(lián)合治療方案，我們參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所頒布的M38?A2方案［10］，以微量液基稀釋法測(cè)定他克莫司、特比萘芬和伊曲康唑?qū)?2株皮炎外瓶霉的抗真菌效應(yīng)；同時(shí)利用棋盤法測(cè)定他克莫司與該兩種抗真菌藥物聯(lián)合的抗皮炎外瓶霉效果。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)菌株

12株皮炎外瓶霉臨床株均保存于荊州市中心醫(yī)院皮膚科真菌實(shí)驗(yàn)室，所有菌株均經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定。每株菌在實(shí)驗(yàn)前均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上活化（35℃，7 d）。ATCC22019為本藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

二、抗真菌藥物

伊曲康唑（批號(hào)84625?61?6，純度＞99%）、特比萘芬（批號(hào)T8826，純度＞99%）和他克莫司（批號(hào)F467，純度＞99%）均為美國Sigma公司產(chǎn)品。將藥物以分析純二甲基亞砜溶解成儲(chǔ)存液，濃度均為1 600 mg/L。

三、微量液基稀釋法

參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所M38?A2方案，按照方案推薦方法配制培養(yǎng)基，用經(jīng)三氮嗎啡丙磺酸鈉緩沖（pH7.0）的RPMI 1640液體培養(yǎng)基過濾滅菌。收集皮炎外瓶霉孢子，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子量為（1～5）×106CFU/ml；然后以RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋100倍，接種終濃度為（1～5）× 104CFU/ml。倍比稀釋后，將2倍終濃度的受試藥物加入96孔板，每孔加入100 μl，再加入100 μl稀釋后的菌懸液，同時(shí)設(shè)立生長對(duì)照（無藥孔）和陰性對(duì)照（無菌孔），35℃孵育72 h。伊曲康唑和特比萘芬的工作濃度范圍均為0.015～2 mg/L，他克莫司為0.125～8 mg/L。肉眼觀察判讀結(jié)果，最低抑菌濃度（MIC）定義為肉眼觀察到無真菌生長的最低濃度。所有的藥敏試驗(yàn)均重復(fù)操作2次。

四、體外聯(lián)合藥物敏感性

藥物聯(lián)合敏感性測(cè)試采用棋盤法，即在96孔板中分別加入不同濃度的兩種藥物。自左向右1～8列為聯(lián)合區(qū)，每孔加入4倍終濃度的藥物倍比稀釋液各50 μl；第1～8列為特比萘芬或伊曲康唑，藥物終濃度為0.015～2 mg/L，每列濃度一致；第1～7行分別加入他克莫司至終濃度為0.125～8 mg/L，每行濃度一致。第9、10列為單獨(dú)用藥區(qū)，藥物終濃度梯度同聯(lián)合區(qū)。同時(shí)設(shè)立生長對(duì)照和空白對(duì)照。接種時(shí)除陰性對(duì)照孔外其余各孔均加入100 μl的2倍終濃度菌懸液，35℃孵育72 h后觀察結(jié)果。分?jǐn)?shù)抑菌濃度判定：與生長對(duì)照孔相比，生長100%抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度，包括各藥物單獨(dú)和聯(lián)合時(shí)的MIC值。聯(lián)合用藥時(shí)各藥物的MIC值分別除以單獨(dú)用藥時(shí)MIC值的商的和，即分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)（FICI）=MIC A聯(lián)合/MIC A單獨(dú)+MIC B聯(lián)合/MIC B單獨(dú)。藥物之間相互作用如下：FICl＜0.5為協(xié)同作用，0.5～4為無相互作用，＞4為拮抗作用。

結(jié)果

一、單藥對(duì)皮炎外瓶霉的體外藥物敏感性

他克莫司單藥對(duì)12株皮炎外瓶霉的MIC均＞8 mg/L。伊曲康唑?qū)?株皮炎外瓶霉的MIC為0.5 mg/L，7株為1 mg/L。特比萘芬對(duì)5株皮炎外瓶霉菌株的MIC為0.125 mg/L，7株為0.06 mg/L。見表1。

表1 伊曲康唑、特比萘芬和他克莫司單用及聯(lián)合抗皮炎外瓶霉效應(yīng)

二、他克莫司聯(lián)合伊曲康唑或特比萘芬對(duì)皮炎外瓶霉的體外藥物敏感性

他克莫司與伊曲康唑聯(lián)合后，伊曲康唑2株0.03 mg/L，4株0.06 mg/L，4株0.125 mg/L，2株0.25 mg/L；他克莫司對(duì)皮炎外瓶霉的MIC 6株降至1 mg/L，6株降至3 mg/L；FICI值顯示，10株FICI＜0.5為協(xié)同作用，2株FICI為0.5～4無相互作用。見表1。

他克莫司與特比萘芬聯(lián)合后，他克莫司對(duì)皮炎外瓶霉的MIC 6株降至0.5 mg/L，3株1 mg/L，3株2 mg/L；特比萘芬3株0.015 mg/L，5株0.03 mg/L，3株0.06 mg/L，1株0.125 mg/L；FICI值顯示，5株FICI＜0.5為協(xié)同作用，7株FICI為0.5～4無相互作用。見表1。

討論

他克莫司是從非致病真菌中提取的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，作用于鈣調(diào)磷酸酶，抑制多種蛋白的去磷酸化過程。鈣調(diào)磷酸酶是鈣依賴性信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)多種真菌胞壁的完整性、菌絲生長、毒力及真菌對(duì)抗真菌藥物耐受都具有重要作用，如念珠菌、曲霉、隱球菌等［11］。他克莫司與抗真菌藥物聯(lián)合對(duì)曲霉、念珠菌、皮膚癬菌、毛霉等多種致病性真菌具有協(xié)同效應(yīng)［6?9］。

皮炎外瓶霉所致皮膚及系統(tǒng)感染治療棘手。盡管體外藥敏提示皮炎外瓶霉抗真菌藥物敏感性尚可，但臨床療效較差［3?5］。伊曲康唑及特比萘芬是目前使用較廣泛的抗真菌藥物。本研究結(jié)果顯示，伊曲康唑及特比萘芬對(duì)皮炎外瓶霉的MIC范圍分別為0.5～1 mg/L及0.06～0.125 mg/L，兩者對(duì)皮炎外瓶霉的體外敏感性較好。雖然他克莫司單用對(duì)皮炎外瓶霉不敏感，但當(dāng)與伊曲康唑和特比萘芬聯(lián)合時(shí)，能夠增加受試菌株對(duì)該兩個(gè)藥物的敏感性。雖然伊曲康唑的MIC均值較特比萘芬高，但他克莫司與伊曲康唑的協(xié)同作用比例（10/12）明顯高于與特比萘芬的協(xié)同作用比例（5/12）。體內(nèi)外研究顯示，抑制鈣調(diào)磷酸酶可增強(qiáng)麥角固醇合成抑制劑（唑類及特比萘芬）抗須毛癬菌、念珠菌、米根霉等作用［12?13］。其潛在機(jī)制可能為他克莫司與麥角固醇合成酶抑制劑聯(lián)合能夠增強(qiáng)致病菌對(duì)唑類藥物敏感性，從抑菌作用轉(zhuǎn)變成殺菌作用；而用麥角固醇抑制劑可導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞內(nèi)他克莫司濃度增加［14?15］。此外，他克莫司與棘白菌素類藥物聯(lián)合對(duì)耐卡泊芬凈念珠菌也具有協(xié)同效應(yīng)［11］。當(dāng)然，其潛在的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究豐富了他克莫司與抗真菌藥物聯(lián)合作用的數(shù)據(jù)，同時(shí)也為皮炎外瓶霉感染的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，由于皮炎外瓶霉體外數(shù)據(jù)和體內(nèi)抗感染效果存在一定差異，還需要更多的研究來進(jìn)一步證實(shí)其在臨床實(shí)踐的可行性。

志謝 北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科李若瑜教授贈(zèng)予皮炎外瓶霉菌株

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In vitroantifungal activity of tacrolimus alone or in combination with itraconazole or terbinafine against

Exophiala dermatitidisHe Chengyan,Sun Yi,Gao Lujuan,Li Ming,Zeng Tongxiang
Department of Dermatology,Jingzhou Central Hospital,The Second Clinical Medical College,Yangtze University,Jingzhou 434100,Hubei,China（He CY,Sun Y,Zeng TX）;Department of Dermatology,

s:Gao Lujuan,Email:gao_lujuan@163.com;Sun Yi,Email:jzzxyysy@163.com

ObjectiveTo evaluatein vitroantifungal activity of tacrolimus combined with itraconazole or terbinafine againstExophiala dermatitidis（E.dermatitidis）.Methods The minimum inhibitory concentrations（MICs）of itraconazole and terbinafine against 12 strains ofE.dermatitidiswere determined using the Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）broth microdilution susceptibility method（M38?A2 Document）.A broth microdilution checkerboard method was used to evaluate thein vitroantifungal activity of tacrolimus combined with itraconazole or terbinafine againstE.dermatitidis.ResultsThe MIC ranges of terbinafine and itraconazole againstE.dermatitidiswere 0.060-0.125 mg/L and 0.5-1 mg/L,respectively.The combination of tacrolimus with terbinafine showed synergistic inhibitory effects against 5 strains ofE.dermatitidis,while the combination of tacrolimus with itraconazole revealed synergistic effects against 10 strains ofE.dermatitidis.No antagonism was observed in either of the two combinations.ConclusionIn vitrocombination of tacrolimus with itraconazole or terbinafine can enhance the antifungal activity of itraconazole or terbinafine againstE.dermatitidis.

Itraconazole;Drug synergism;In vitro;Exophiala dermatitidis;Tacrolimus;Terbinafine

高露娟，Email：gao_lujuan@163.com；孫毅，Email：jzzxyysy@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.04.011

國家自然科學(xué)基金（81401677、31400131）；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院優(yōu)秀青年醫(yī)師計(jì)劃（2015ZSYXQN21）

Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China（Gao LJ,Li M）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31400131,81401677）;Outstanding Youth Project of Zhongshan Hospital Fudan University（2015ZSYXQN21）

2016?08?12）

（本文編輯：吳曉初）