白莉艷，類延娜，成憲武，李香

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

組織蛋白酶S對(duì)小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成的影響

白莉艷，類延娜，成憲武，李香

目的：探討組織蛋白酶S (CatS)對(duì)小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成的影響。

方法：分別在C57BL6野生型雄性小鼠（CatS+/+組）和CatS基因敲除雄性小鼠（CatS-/-組）建立下肢缺血模型，每組8只，分別測定術(shù)前、術(shù)后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流進(jìn)行比較分析。再將CatS+/+組小鼠，分為正常對(duì)照亞組、選擇性CatS抑制劑（LHVS）亞組、非選擇性CatS抑制劑（E64d）亞組和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）抑制劑（GM6001）亞組，每組2只，觀察小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成情況。用免疫熒光法異硫氰酸熒光素（FITC）-CD31標(biāo)記微管腔形成情況。

結(jié)果：（1）CatS-/-組小鼠明顯抑制下肢血流的恢復(fù)。用激光多普勒超聲血流儀檢測下肢血流，缺血與非缺血下肢血流比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：CatS-/-組小鼠術(shù)后第7、14、21天缺血下肢血流恢復(fù)均明顯慢于CatS+/+組（P均＜0.05）。（2）CatS-/-組小鼠的主動(dòng)脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+組小鼠比較明顯減少，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。（3）LHVS、E64d以及GM6001亞組分別與正常對(duì)照亞組比較，均明顯抑制主動(dòng)脈環(huán)微管腔的形成，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。（4）主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)形成的微管腔由內(nèi)皮細(xì)胞組成。

結(jié)論：CatS在缺血性血管再生中發(fā)揮有益的作用，不但增加了主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成的數(shù)量，并且促進(jìn)了缺血下肢的血流恢復(fù)。這些結(jié)果為尋找下肢缺血性血管再生提供了理論依據(jù)。

組織蛋白酶類；微管腔；血管再生

下肢動(dòng)脈硬化性疾病（LEAD）其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。國外研究顯示,LEAD 患者伴有持續(xù)性疼痛者占28%，需要血管重建或截肢手術(shù)者占8.2%。更觸目驚心的臨床研究報(bào)道，LEAD嚴(yán)重肢體缺血患者1年病死率約25%，截肢率高達(dá)45%[1]。2002年，血管內(nèi)介入治療問世后，給LEAD的臨床治療帶來希望，但是，術(shù)后早中期25%～45%支架內(nèi)再狹窄等，束縛了LEAD介入治療的廣泛臨床應(yīng)用[2]。被譽(yù)為分子搭橋術(shù)的血管再生醫(yī)學(xué)引起全世界醫(yī)學(xué)專家的注目。然而，缺血后血管再生及細(xì)胞治療的分子機(jī)制尚不明確。因此，尋找下肢缺血性血管再生的治療靶點(diǎn)、明確其作用機(jī)制、開發(fā)有效安全的治療措施成為各國醫(yī)學(xué)專家共同的任務(wù)和亟需解決的難題。本研究旨在觀察組織蛋白酶S （CatS）對(duì)小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成的影響，為尋找下肢缺血性血管再生的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物來源及分組：8周齡C57BL6野生型雄性小鼠（CatS+/+組）和8周齡CatS基因敲除雄性小鼠（CatS-/-組）由日本名古屋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，體重為21～25 g。第一組實(shí)驗(yàn)：分別在CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠建立下肢缺血模型，每組8只。分別測定術(shù)前、術(shù)后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流進(jìn)行比較分析。第二組實(shí)驗(yàn)：再將CatS+/+組小鼠，分為正常對(duì)照亞組、選擇性CatS抑制劑（LHVS）亞組、非選擇性CatS抑制劑（E64d）亞組和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）抑制劑（GM6001）亞組，每組2只，觀察小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成情況。用免疫熒光法異硫氰酸熒光素（FITC）-CD31標(biāo)記微管腔形成情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

下肢缺血模型的建立：首先分離股神經(jīng)后結(jié)扎股動(dòng)脈根部，剝離股動(dòng)脈三個(gè)主要分支并結(jié)扎，然后切除股動(dòng)脈主干及其分支，建立下肢缺血模型。激光多普勒血流儀測定下肢血流：采用Laser Doppler Perfusion Imager （Lisca AB 公司）的激光多普勒血流儀，測量術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)（左側(cè)下肢）和對(duì)側(cè)非缺血側(cè)（右側(cè)下肢）的血流灌注情況。每次測量之前，給予小鼠腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉后采取仰臥位，置于37℃條件下15 min。仰臥位掃描之后，存儲(chǔ)圖像，圖像存儲(chǔ)形式為整個(gè)雙下肢區(qū)域的二維圖像，經(jīng)過PIMⅡPatch Test WIZARD軟件分析，血流灌注情況表示平均的激光多普勒血流值。用每只小鼠同一時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)與非缺血側(cè)的血流灌注情況的比值表示其缺血下肢血流恢復(fù)情況。

1.3 小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn)步驟

取材：心臟采血處死小鼠，體式顯微鏡下鈍性分離小鼠胸主動(dòng)脈，使用顯微剪和眼科鑷小心剔除血管周圍脂肪及結(jié)締組織。將分離的主動(dòng)脈轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基中[3]。消化：取下胸主動(dòng)脈后，將其置于預(yù)先復(fù)溫的Ⅱ型膠原酶（ 2 g/L） 中，放入37℃ 培養(yǎng)箱消化6～7 min，主動(dòng)脈內(nèi)插入球囊，將內(nèi)皮細(xì)胞層朝外。饑餓：盡可能將血管均勻地剪成約1 mm長的動(dòng)脈環(huán)。取出動(dòng)脈環(huán)放入無血清培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中饑餓過夜。Ⅰ型膠原包埋主動(dòng)脈環(huán)：預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋膠原至終濃度為 1 g/L，使用 NaOH（ 200 g/L） 調(diào)整 pH 至 7.4。Ⅰ型膠原以約200 μl/孔包被預(yù)冷的24 孔板，將動(dòng)脈環(huán)包埋入液態(tài)基質(zhì)膠。24孔板在室溫平衡10 min后放入37℃培養(yǎng)箱，孵育30 min，待膠原凝固后，正常對(duì)照亞組和LHVS亞組、E64d亞組和GM6001亞組，均加入DMEM +血管內(nèi)皮生長因子（ VEGF，50 ng /ml） 100 μl /孔覆蓋膠原表面，隔天換液，培養(yǎng)7天。其中，LHVS濃度為5 nmol/L，E64d濃度為 10 μmol/L，GM6001濃度為 20 μmol/L。在倒置顯微鏡下觀察主動(dòng)脈環(huán)微管腔出芽面積（×200倍放大）。出芽面積用定量分析區(qū)域內(nèi)血管每個(gè)圖像的像素所占的百分比表示。

1.4 主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)

用分子遺傳學(xué)觀察血管生成的新方法，觀察內(nèi)皮細(xì)胞組成的微血管網(wǎng)絡(luò)。CatS+/+小鼠反轉(zhuǎn)后的主動(dòng)脈環(huán)，置于預(yù)先包被有Collagen type l膠原的6 cm的培養(yǎng)皿中，給予VEGF（最終濃度為50 ng/ml）+內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2（EBM-2）中培養(yǎng)7天。然后用免疫熒光法FITC-CD31標(biāo)記微血管出芽情況。將1：100配成的FITC mouse anti-humenCD31置入后，37℃ 培養(yǎng) 90 min，0.01 M PBS（0.2 M Na2HPO411.5 g, NaH2PO4·2H2O 2.2 g, NaCl 80 g 溶于 1 000 ml水，pH=7.4）清洗3次，多聚甲醛溶液（4%PFA）主要由多聚甲醛、磷酸鹽、去離子水組成，pH=7.4，室溫浸泡10 min后， PBS清洗3次，玻片上涂4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI），將動(dòng)脈環(huán)封片后熒光顯微鏡觀察[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS15.0分析系統(tǒng)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±sE）表示，用student的非配對(duì)T檢驗(yàn)或Tukey post hoc test 雙因素多重統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CatS+/+ 和CatS-/- 兩組小鼠缺血與非缺血下肢血流的動(dòng)態(tài)變化（圖1）。

CatS-/-組小鼠明顯抑制下肢血流的恢復(fù)。觀察到術(shù)后即刻、術(shù)后1天血流明顯下降,術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù)，術(shù)后第7、14、21天CatS-/-組小鼠缺血下肢血流恢復(fù)均明顯慢于CatS+/+組（P均＜0.05）。

圖1 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠缺血與非缺血下肢血流的動(dòng)態(tài)變化（n=8）

2.2 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成（圖2）

CatS-/-組小鼠的主動(dòng)脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+組小鼠比較明顯減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.3 利用組織蛋白酶S抑制劑（LHVS，E64d）及MMP抑制劑（GM6001）觀察小鼠

主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成情況（圖3）。LHVS、E64d亞組以及GM6001亞組分別與正常對(duì)照亞組比較，明顯抑制主動(dòng)脈環(huán)微管腔的形成，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖2 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成（n=4，×200）

圖3 各亞組小鼠主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成情況（n=2，×200）

2.4 小鼠主動(dòng)脈環(huán)的免疫熒光鑒定（圖4）。

倒置顯微鏡下觀察，綠色熒光為內(nèi)皮細(xì)胞由FITC- CD31特異性標(biāo)記，藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核。在免疫組化中，CD31是主要用于證明內(nèi)皮細(xì)胞的存在。結(jié)果表明：主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)以后形成的微管腔由內(nèi)皮細(xì)胞組成

圖4 小鼠主動(dòng)脈環(huán)的免疫熒光鑒定（×200）

3 討論

2004年，Cheng等[5，6]報(bào)道了CatS 在損傷性增生內(nèi)膜及心力衰竭心肌中表達(dá)明顯增高，并在心血管重構(gòu)中起著重要作用。此后，也發(fā)現(xiàn)CatS主要在血管平滑肌細(xì)胞膜外與ανβ3 整合素結(jié)合，調(diào)控平滑肌細(xì)胞的移動(dòng)及浸潤功能[7]。藥物干預(yù)CatS可以抑制動(dòng)脈斑塊形成及改善斑塊穩(wěn)定性[8]。這些研究結(jié)果提示，CatS參與動(dòng)脈粥樣斑塊形成、發(fā)展、破裂和破裂后修復(fù)的全過程。以往的散在報(bào)道顯示：CatS一方面通過降解、失活成纖維細(xì)胞生長因子（BFGF）或分解4型膠原蛋白產(chǎn)生具有抗血管再生活性的血管抑制素，另一方面通過修飾以及釋放血管生長調(diào)節(jié)因子控制腫瘤血管新生[9]。2010年島田等日本學(xué)者利用基因敲除或藥物干預(yù)方法驗(yàn)證骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞-組織蛋白酶L 在角膜和脈絡(luò)膜血管再生過程中作用[10]。Urbich 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮祖細(xì)胞中組織蛋白酶L高水平表達(dá)，并促使骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢于缺血血管床中發(fā)揮了重要作用。以上研究結(jié)果揭示：CatS在動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[12]，亦可能參與血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能調(diào)控。下肢缺血性疾病最主要的病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化，因此，CatS可以成為參與缺血性血管再生的關(guān)鍵成員。

本研究結(jié)果表明：（1）CatS-/-組小鼠下肢血流的恢復(fù)明顯受到抑制。用激光多普勒超聲血流儀檢測下肢血流，缺血與非缺血下肢血流比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：CatS-/-組小鼠術(shù)后第7、14、21天缺血下肢血流恢復(fù)均明顯慢于CatS+/+組（P均＜0.05）。（2）CatS-/-小鼠的主動(dòng)脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+小鼠比較明顯減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。（3）LHVS亞組、E64d亞組以及GM6001亞組分別與正常對(duì)照亞組比較，均明顯抑制主動(dòng)脈環(huán)微管腔的形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。（4）主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)形成的微管腔由內(nèi)皮細(xì)胞組成。目前較多的研究集中于CatS在動(dòng)脈硬化性心血管疾病中的表達(dá)及其作用，而CatS在缺血性血管生成中表達(dá)及其作用尚少見報(bào)道[13]。本研究提示：CatS在缺血性血管再生中發(fā)揮有益的作用，不但增加了主動(dòng)脈環(huán)微管腔形成的數(shù)量，并且促進(jìn)了缺血下肢的血流恢復(fù)。這些結(jié)果為尋找下肢缺血性血管再生提供了理論依據(jù)。

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Impact of Cathepsins S on Aortic Ring-derived Micro Vascular Cavity Formation in Experimental Mice

BAI Li-yan, LEI Yan-na, CHENG Xian-wu, LI Xiang.
Department of Cardiology, Yanbian University Affiliated Hospital, Yanji (133000), Jilin, China
Corresponding Author: LI Xiang, Email:15526770377@163.com

Objective: To investigate the impact of cathepsins S (CatS) on aortic ring-derived micro vascular cavity formation in experimental mice.

Methods: Hindlimb ischemia model was established in CatS+/+and CatS-/-mice,n=8 in each group. The blood fl ow in hindlimb was measured before is chemic surgery; immediately and 1, 4, 7, 14, 21 days after surgery. CatS+/+mice were further divided into 4 subgroups: Normal control subgroup, Selective CatS inhibitor (LHVS) subgroup, Non-selective CatS inhibitor(E64d) subgroup and MMP inhibitor (GM6001) subgroup;n=2 in each subgroup. The mice aortic ring-derived micro vascular cavity formation was observed by FITC-CD31 immunof l uorescence method.

Results:①CatS-/-mice had inhibited blood fl ow recovery after is chemic surgery. Laser Doppler blood fl ow (LDBF)examination indicated that compared with CatS+/+group, CatS-/-group had slower hindlimb blood flow recovery,P＜0.05;②CatS-/-group had the less aortic ring-derived micro vascular cavities,P＜0.001.③Compared with Normal control subgroup,LHVS subgroup, E64d subgroup and GM6001 subgroup had suppressed micro vascular cavity formation, allP＜0.05.④Aortic ring-derived micro vascular cavity was composed by endothelial cells.

Conclusion: CatS plays a beneficial role in is chemic vascular regeneration in experimental mice; it is not only increasing aortic ring-derived micro vascular cavity formation, but also promoting blood flow recovery in is chemic hindlimb. Our finding provides a theoretical basis for new therapeutic target in is chemic vascular regeneration.

Cathepsins; Micro vascular cavity; Vascular regeneration

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:1015.)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81660240）

133000 吉林省延吉市，延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科（白莉艷、成憲武、李香），重癥監(jiān)護(hù)病房（類延娜）

白莉艷 住院醫(yī)師 碩士研究生 主要從事組織蛋白酶與心血管疾病發(fā)病機(jī)制的研究 Email: zhongtian200330@163.com 通訊作者：李香Email:15526770377@163.com

R54

A

1000-3614（2017）10-1015-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.018

2016-11-01）

（編輯：王寶茹）