蔣立英

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城224000）

大孔樹脂純化黃花敗醬總皂苷提取物工藝研究

蔣立英

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城224000）

以黃花敗醬皂苷提取物為原料，吸附率與洗脫率為衡量指標(biāo)，考察5種大孔樹脂對黃花敗醬提取物中皂苷類化合物的靜態(tài)吸附與洗脫性能，結(jié)合靜態(tài)吸附動力學(xué)研究，確定選擇AB-8型大孔樹脂純化黃花敗醬提取物中皂苷類化合物。利用動態(tài)吸附-洗脫試驗，得出最佳純化工藝條件為：配置0.30 mg/mL的黃花敗醬提取液，以2 BV/h流速，上樣至徑高比為1∶10的AB-8型樹脂中吸附，隨后采用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脫。經(jīng)高效液相色譜法定量分析表明，黃花敗醬提取物中總皂苷含量由純化前350.6 mg/g提高至純化后846.9 mg/g。

黃花敗醬；總皂苷；大孔樹脂；純化

黃花敗醬系屬敗醬科敗醬屬植物黃花敗醬的根、莖或帶根全草，在我國分布廣泛，因具有清熱解毒、活血破瘀、鎮(zhèn)心安神之功效，而用于各類疾病的治療[1-3]。黃花敗醬所含化學(xué)成分種類豐富，主要為三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、香豆素類、揮發(fā)油類、倍半萜類和木脂素類[4-6]。由于其有效成分三萜皂苷類化合物（皂苷甘元：齊墩果酸）具有促進肝細胞再生、防止肝硬化、拮抗腫瘤細胞生長、增強機體免疫功能等作用[7-9]，從而前人對其有效提取與分離作了大量工作[10-11]，但諸多提取方法產(chǎn)物均含有較多雜質(zhì)，使得目標(biāo)產(chǎn)物含量偏低，影響功效發(fā)揮。

大孔樹脂吸附分離，綜合機械篩分與化學(xué)吸附的優(yōu)點，具有選擇性高、干擾因素少、可重復(fù)循環(huán)利用等特點，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的分離和純化[12-13]。本研究在黃花敗醬總皂苷提取工藝研究的基礎(chǔ)上，利用大孔樹脂純化提取產(chǎn)物，采取高效液相色譜法定量分析，探究最佳純化工藝，為黃花敗醬皂苷類化合物的進一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃花敗醬全草：湖北隨州。

齊墩果酸：定量分析用，中國藥品生物制品檢定所；甲醇、甲酸：色譜純；其余試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

1290型高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；AE224型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；878-A/B型高速多功能粉碎機：常州國華電器有限公司；AB-8、D101型大孔樹脂：陜西藍深陜特種樹脂有限公司；HPD-300、HPD-600型大孔樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；NKA-9：南開化工有限公司；HH-1J恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

取黃花敗醬全草1 kg，清水洗凈，40℃下烘干，完全粉碎后過80目篩。精密稱取粉末10.0 g，采用10倍量的60%乙醇溶液回流提取兩次，每次2 h，合并提取液濃縮后，加入乙醇20 mL與鹽酸4 mL，加熱水解4 h，蒸干即得黃花敗醬總皂苷提取物[10]。

1.2.2 定量分析方法

1.2.2.1 對照品溶液配制

稱取齊墩果酸對照品0.025g，加入甲醇溶液溶解完全后，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，搖勻，得到濃度為1.0mg/mL的對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液配制

稱取黃花敗醬提取物0.01 g，加入甲醇超聲完全溶解后，過濾，濾液定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，搖勻。

1.2.2.3 色譜條件

采用Ultimate xB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.5%甲酸；梯度洗脫程序（0～30 min，70%→95%A）；流速 1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、5.0 mL 置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度搖勻，按照“1.2.2.3”項的色譜條件，分別連續(xù)進樣3次，以齊墩果酸濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程Y=2 475.1X+1 587.4（r=0.9997），結(jié)果表明，齊墩果酸濃度在50μg/mL～500μg/mL時，線性關(guān)系良好。

2.2 含量測定

取供試液 10 μL，按照“1.2.2.3”項的色譜條件，連續(xù)進樣3次，按照外標(biāo)法以峰面積計算出樣品提取物中總皂苷含量，結(jié)果見表1所示。

表1 黃花敗醬提取物中總皂苷含量Table 1 The content of total saponins of Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract

2.3 純化工藝研究

2.3.1 樹脂預(yù)處理

將大孔樹脂浸泡于90%乙醇中24 h，充分溶脹后濕法裝柱，后用90%乙醇反復(fù)沖洗，直至流出液與水混合（V液∶V水=1∶5）無白色渾濁出現(xiàn)，再用水洗至無乙醇氣味，加入3%鹽酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h，用水洗至中性，備用[15]。

2.3.2 大孔樹脂型號篩選

稱取2.0g5種不同類型的大孔樹脂（D101、HPD-300、AB-8、NKA-9、HPD-600）于錐形瓶內(nèi)，分別加入等濃度的黃花敗醬總皂苷提取液50 mL，放置于振動器中，靜態(tài)吸附24 h，使大孔樹脂吸附總皂苷達到飽和，隨后過濾，蒸干濾液。通過下式計算得到不同類型大孔樹脂靜態(tài)飽和吸附量與吸附率。

式中：m0為提取液總皂苷質(zhì)量，mg；me為飽和吸附后濾液中總皂苷質(zhì)量，mg；m為干燥的大孔樹脂質(zhì)量，g；Γe為靜態(tài)飽和吸附量，mg/g；Qe為靜態(tài)飽和吸附率，%。

將過濾后的樹脂置于錐形瓶內(nèi)，加入60%乙醇30 mL，放于振動器中，洗脫24 h，過濾，測定濾液總皂苷含量，通過下式計算洗脫率與回收率。不同類型樹脂對黃花敗醬提取物中總皂苷的吸附量、吸附率和洗脫率與回收率結(jié)果見表2所示。

式中：m0為提取液總皂苷質(zhì)量，mg；me為飽和吸附后濾液中總皂苷質(zhì)量，mg；md為洗脫液總皂苷質(zhì)量，mg；Dd為靜態(tài)洗脫率，%；R為回收率，%。

表2 不同類型樹脂的靜態(tài)吸附與洗脫性能比較Table 2 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

從表2中可知，AB-8型大孔樹脂的吸附率、洗脫率及回收率均高于其它4類樹脂，分別達到87.16%、95.5%和83.24%，這歸因于黃花敗醬總皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有羧基和羥基，具有一定的極性，AB-8型大孔樹脂特殊的空間結(jié)構(gòu)與弱極性，恰好與總皂苷容易產(chǎn)生較好的物理吸附和洗脫，從而確定其作為純化黃花敗醬總皂苷的吸附樹脂。

2.3.3 AB-8型大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)

根據(jù)“2.3.2”中靜態(tài)吸附試驗條件，在不同時間段測定AB-8型大孔樹脂靜態(tài)吸附總皂苷質(zhì)量，繪制靜態(tài)吸附動力曲線，見圖1所示。

圖1 AB-8型大孔樹脂靜態(tài)吸附動力曲線Fig.1 Static adsorption curve of AB-8 resin

在0～6 h范圍內(nèi)，吸附量隨著時間的增長而增大，隨后達到飽和狀態(tài)。AB-8型大孔樹脂靜態(tài)吸附黃花敗醬提取物中總皂苷耗時理想，能夠滿足相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)要求。

2.3.4 吸附條件研究

采用L9（34）正交試驗法，以總皂苷動態(tài)吸附量為衡量指標(biāo)，考察上樣液質(zhì)量濃度、上樣流速和徑高比對吸附效果的影響，相關(guān)因素水平表見表3所示。按照正交試驗表中條件（表4），配置9份等體積不同濃度的黃花敗醬總皂苷提取液，上樣至預(yù)處理完成的等量大孔樹脂中吸附，收集流出液，蒸干，測定總皂苷量，相關(guān)方差分析見表5所示。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Table of the factorial experiment

表4 吸附條件正交試驗結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal-test method of adsorption factors

表5 總皂苷吸附條件方差分析Table 5 Analysis of variance for the adsorption factors of total saponins

從表4和表5的結(jié)果分析可知，各因素對大孔樹脂吸附黃花敗醬提取物中總皂苷效果的影響順序為A＞C＞B，上樣液質(zhì)量濃度對吸附效果影響顯著，最佳吸附工藝條件為A2B2C3。上樣液總皂苷濃度越大，單位面積樹脂的吸附量越多，當(dāng)濃度大到一定程度時，傳質(zhì)減慢，樹脂吸附達到飽和，未被吸附的總皂苷則泄露流出。同時，較慢的上樣流速有利于吸附，但過慢會使得效率降低、時間延長，而太快又不利于有效成分被充分吸附，從而選擇配置0.30 mg/mL的黃花敗醬提取液，以2 BV/h流速，上樣至徑高比為1∶10的AB-8型大孔樹脂中，吸附黃花敗醬提取液中總皂苷。

2.3.5 洗脫條件研究

吸附后的樹脂需進行洗脫，才能得到含量較高的皂苷類化合物，為此以總皂苷動態(tài)洗脫率為衡量指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗法，考察洗脫劑乙醇體積分數(shù)、流速和用量對洗脫效果的影響，相關(guān)因素水平見表6所示。依照正交試驗表所述條件（表7）進行洗脫，收集9份洗脫液，減壓濃縮，真空干燥后，測定總皂苷洗脫量，計算洗脫率，相關(guān)方差分析見表8所示。

表6 正交試驗因素水平表Table 6 Table of the factorial experiment

表7 洗脫條件正交試驗結(jié)果Table 7 Results of the orthogonal-test method of desorption factors

表8 總皂苷洗脫條件方差分析Table 8 Analysis of variance for the desorption factors of total saponins

從表7和表8的結(jié)果分析可知，各因素對洗脫效果影響的順序為A＞C＞B，乙醇濃度對洗脫效果影響顯著，最佳洗脫工藝條件為A3B2C2。乙醇體積分數(shù)越大，則洗脫劑極性愈小，愈容易將總皂苷從樹脂表面洗脫，另外適當(dāng)?shù)南疵摿魉僖灿欣趯⒛繕?biāo)化合物充分洗脫，不延長洗脫時間，從而確定選用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脫樹脂吸附的黃花敗醬提取物中的總皂苷，洗脫率為97.02%。

2.4 純化前后總皂苷含量的比較

純化黃花敗醬提取物中總皂苷的最佳工藝為：配置0.30 mg/mL的黃花敗醬提取物，以2 BV/h流速，上樣至徑高比為1∶10的AB-8型大孔樹脂中吸附，隨后采用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脫。純化后樣品高效液相色譜圖見圖2所示，純化前后黃花敗醬提取物的總皂苷含量見表9。

圖2 純化后樣品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample after purification

表9 純化前后黃花敗醬提取物的總皂苷含量Table 9 The content of total saponins of Patrinia Scabiosaefolia Fisch extracts before and after purification

從表9結(jié)果可知，黃花敗醬總皂苷含量由純化前350.6 mg/g提高至純化后846.9 mg/g，為純化前的2.42倍。

3 結(jié)論

本研究選用了5種大孔樹脂純化黃花敗醬提取物中的總皂苷，研究結(jié)果顯示：配置0.3 mg/mL的黃花敗醬提取物，以2 BV/h流速，上樣至徑高比為1∶10的AB-8型樹脂中吸附，隨后采用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脫，所得洗脫液總皂苷含量為純化前的2.42倍。該工藝操作簡便、純化效率較高，從而可推廣至相關(guān)工業(yè)應(yīng)用中。

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Study of the Purification Technology for Total Saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch by Macroporous Resin

JIANG Li-ying
（College of Pharmacy，Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng 224000，Jiangsu，China）

In order to find the most appropriate macroporous resin to purify total saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract.The static adsorption and desorption performance of five kinds of macroporous resins and combined with the kinetics of static adsorption for total saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract were investigated by different adsorption and desorption ratios.AB-8 resin was found to be suitable for the purification of total saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch by using dynamic adsorption and desorption experiments，the optimum purification conditions were obtained as follows：0.3 mg/mL Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract was loaded on to the resin column which the ratio of diameter-high was 1∶10 at flow rate of 2 BV/h and eluted with 5 BV of 70%ethanol at flow rate of 2 BV/h.Under these conditions，the content of total saponins of Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract was increased from 350.6 mg/g to 846.9 mg/g by quantitative analysis of high performance liquid chromatography.

Patrinia Scabiosaefolia Fisch；total saponins；macroporous resin；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.007

江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項目（PPZY2015A097）；商丘市科技局科技公關(guān)項目（153063）

蔣立英（1971—），女（漢），主管藥師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物分析。

2017-02-07