陳雪，劉韓，裴芳藝，劉振艷，侯惠玲，郭皓，丁琳，

楊文欽1，臧傳剛1，劉宇超1，關(guān)宏1*

1(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，學(xué)院辦公室，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

熒光定量PCR法計(jì)數(shù)農(nóng)家干酪中動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種

陳雪1，劉韓2*，裴芳藝1，劉振艷1，侯惠玲1，郭皓1，丁琳1，

楊文欽1，臧傳剛1，劉宇超1，關(guān)宏1*

1(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，學(xué)院辦公室，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

分別利用熒光定量PCR及平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)農(nóng)家干酪中雙歧桿菌的菌體數(shù)，通過對(duì)結(jié)果的比較分析，建立一種適用于快速、敏感、特異的檢測(cè)干酪中雙歧桿菌活菌數(shù)的方法。利用傳統(tǒng)工藝制備雙歧桿菌農(nóng)家干酪，在其貯存期間分別采用熒光定量PCR及平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)干酪中雙歧桿菌的數(shù)量。其中，在利用熒光定量PCR法檢測(cè)時(shí)，對(duì)影響PCR定量準(zhǔn)確的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，包括設(shè)計(jì)雙歧桿菌引物，并對(duì)引物特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)、考察，從干酪基質(zhì)中提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物特異性驗(yàn)證結(jié)果表明，引物專一性強(qiáng)。采用試劑盒法從干酪樣品中提取DNA的純度較好，OD260/OD280均在1.75～1.82之間。除貯存第1天外，熒光定量PCR法計(jì)數(shù)結(jié)果比平板計(jì)數(shù)法高0.39%～2.25%，未見顯著差異。熒光定量PCR具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便和快速的特點(diǎn),可用于干酪中雙歧桿菌的定量檢測(cè)。

熒光定量PCR；干酪；雙歧桿菌

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是一種厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，它作為維持人體腸道菌群平衡的有益菌[1]，被廣泛應(yīng)用于乳制品的制作中，如發(fā)酵乳、冰激凌、酸奶及干酪等[2]。不僅如此，它還具有提高機(jī)體免疫力[3]、降低結(jié)腸癌發(fā)病率、抗腫瘤、延緩衰老等一系列保健功能[4-6]，近年來(lái)備受人們青睞。與酸奶和發(fā)酵乳相比，干酪作為雙歧桿菌等益生菌載體更具有優(yōu)勢(shì)：(1)干酪pH值相對(duì)較高，一般在pH 4.8～5.6之間，高于發(fā)酵乳的pH 3.7～4.3。(2)厭氧環(huán)境。干酪結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)部氧化還原電位極低，其內(nèi)部環(huán)境可以認(rèn)為是厭氧環(huán)境，這有利于雙歧桿菌類嚴(yán)格厭氧的益生菌生長(zhǎng)。(3)緩沖力強(qiáng)。干酪結(jié)構(gòu)致密且蛋白、脂肪含量高，這為益生菌通過胃腸道提供了保護(hù)作用[7-8]。

在益生菌食品中只有當(dāng)益生菌保持一定活力且具有一定數(shù)量時(shí)才能發(fā)揮其益生作用。然而，市場(chǎng)上銷售的益生菌產(chǎn)品通常會(huì)出現(xiàn)益生菌活菌數(shù)較低甚至不含益生菌等問題。事實(shí)表明，大多數(shù)菌株均具有非常相似的表型特性，利用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法計(jì)數(shù)時(shí)不僅費(fèi)時(shí)且選擇性差，只能計(jì)數(shù)能夠生長(zhǎng)的菌株而對(duì)處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌無(wú)法檢測(cè)。此外，在混合發(fā)酵體系中，當(dāng)其他菌株數(shù)量占優(yōu)勢(shì)且也能在相同的培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)也無(wú)法用平板法檢測(cè)其益生菌數(shù)[9]。因此，需要建立一種有效和快速的方法來(lái)鑒別益生菌同時(shí)計(jì)數(shù)活菌數(shù)[10]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，在體系中加入熒光基團(tuán)(通常為熒光染料或探針)，實(shí)時(shí)通過熒光信號(hào)的積累監(jiān)測(cè)PCR的進(jìn)程[11]。該方法以菌體DNA為模板，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定菌株在樣品中的數(shù)量，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)該方法廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中益生菌和致病菌的檢測(cè)。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種QYW-BB06為研究對(duì)象，將其作為附屬發(fā)酵劑添加到農(nóng)家干酪中。在干酪貯存的20天內(nèi)，每隔5天利用熒光定量PCR方法檢測(cè)干酪中雙歧桿菌的活菌數(shù)，并與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)方法作對(duì)比。同時(shí)，對(duì)影響PCR定量準(zhǔn)確的因素：引物特異性、在干酪基質(zhì)中提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨為建立一種準(zhǔn)確、快速的測(cè)定農(nóng)家干酪中雙歧桿菌數(shù)量的方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌種

長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(Bifidobacteriumlongumsubsp.longum)QYW-LB01，動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)QYW-BB06。以上菌種均保藏于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)脫脂乳培養(yǎng)基：100 g/L 脫脂乳，10 g/L 酵母精；(2)改良MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加0.5 g/L的半胱氨酸[12]；(3)含莫匹羅星鋰鹽的MRS培養(yǎng)基：在改良MRS培養(yǎng)基中加入莫匹羅星鋰鹽50 mg/L；(4)M17培養(yǎng)基：購(gòu)買于青島海博生物有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega公司；SYBR Premix Ex TaqTM，TaKaRa公司；ABI7300實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀，ABI公司；梯度PCR儀、全自動(dòng)熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，Bio-RAD公司；厭氧操作培養(yǎng)箱，SHEL LAB 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、Nano Drop紫外分光光度計(jì)，賽默飛公司。

1.3菌株復(fù)蘇及DNA提取

將保藏的菌種分別以3區(qū)劃線方式接種到固體改良MRS培養(yǎng)基中，37 ℃、厭氧培養(yǎng)48 h后用滅菌牙簽挑取單菌落，分別接種到1 mL新鮮液體改良MRS培養(yǎng)基中，37 ℃、厭氧培養(yǎng)24 h。按5%的接種量繼續(xù)擴(kuò)培菌體，待菌體活力恢復(fù)后備用。

菌體DNA提取方法按照Wizard Genomic DNA Purification Kit的說明書步驟進(jìn)行提取，將溶菌酶的濃度提高至50 mg/mL。取適量干酪發(fā)酵劑(含乳酸乳球菌)用M17培養(yǎng)基擴(kuò)培菌體后直接提取DNA。

1.4繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

取經(jīng)連續(xù)10倍稀釋的已知量B.animalissubsp.lactisQYW-BB06DNA作為熒光定量PCR模板，以其已知量的不同菌數(shù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(lg CFU/g)，以反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.113x+39.121，斜率為-3.113，線性回歸系數(shù)R2為0.995 95，PCR擴(kuò)增效率E=101/3.113-1=1.095，即109.5%。通過測(cè)得的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中求出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)對(duì)數(shù)值，再反求其對(duì)數(shù)，計(jì)數(shù)樣品中的雙歧桿菌。

1.5引物設(shè)計(jì)及引物特異性驗(yàn)證

1.5.1 引物設(shè)計(jì)

動(dòng)物雙歧桿菌特異性引物的設(shè)計(jì)基于延伸因子tal基因的1個(gè)片段。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物均用TE稀釋制成100 μmol/L的貯存液。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.5.2 PCR法對(duì)引物特異性的驗(yàn)證

采用PCR法，用雙歧桿菌特異性引物擴(kuò)增目的菌株DNA模板(B.animalissubsp.lactisQYW-BB06)及非目的菌株DNA模板(乳酸乳球菌)。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL，10×buffer 2 μL，dNTPS(2.5 mmol/L)1.6 μL，雙歧桿菌上下游引物(10 μmol /L)各0.4 μL，r-Taq(5v/μL)0.4 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL，設(shè)置3個(gè)平行樣品。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞，橫線處共20個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 熒光定量PCR法對(duì)引物特異性的驗(yàn)證[9]

采用熒光定量PCR法，用雙歧桿菌特異性引物分別擴(kuò)增目的菌株DNA模板(B.animalissubsp.lactisQYW-BB06)及非目的菌株DNA模板(乳酸乳球菌、B.longumsubsp.longumQYW-LB01)。在反應(yīng)體系中，各菌株DNA模板量為50 ng。

將目的菌株DNA與非目的菌株DNA混合，且在非目的菌株DNA濃度較高的體系中驗(yàn)證引物的特異性。目的菌株DNA與非目的菌株DNA濃度比設(shè)置為1∶1、1∶50、1∶150及1∶1 000。

熒光定量PCR體系及反應(yīng)條件：熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR premix ExTaq10 μL、正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL、ROX reference dye 0.4 μL、DNA模板2 μL及滅菌雙蒸水6.8 μL補(bǔ)足至20 μL，每個(gè)DNA模板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，橫線處共40個(gè)循環(huán)。

1.6農(nóng)家干酪樣品

樣品制作工藝流程：鮮牛乳→過濾、殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(32 ℃)→接種動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(108CFU/mL接種)→接種商業(yè)直投式發(fā)酵劑(包含乳酸乳球菌乳酸亞種及乳酸乳球菌乳脂亞種)→添加氯化鈣(0.1 g/L)→添加凝乳酶→凝乳→切割凝塊→靜置→熱燙→排乳清→水洗→堆積→鹽漬→包裝，4 ℃貯存。

1.7計(jì)數(shù)干酪樣品中的雙歧桿菌

在干酪貯存的第1、5、10、15、20天時(shí)分別使用平板菌落計(jì)數(shù)法及熒光定量PCR法計(jì)數(shù)干酪中雙歧桿菌菌體數(shù)。

1.7.1 從干酪樣品中取樣

無(wú)菌條件下稱取10 g干酪樣品與90 mL滅菌的2%檸檬酸三鈉-4%聚乙二醇8 000混合，室溫下放置10 min，勻漿5 min。取1 mL混合溶液，使用含莫匹羅星鋰鹽的MRS培養(yǎng)基，傾注法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)；另取1 mL混合溶液提取DNA。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取干酪樣品中DNA，具體操作參照ABDULAMIR等人的方法[14]。利用紫外分光光度法分析DNA的濃度及純度。DNA純度的表達(dá)方式為OD260與OD280的比值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件中的方差分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)p<0.05為差異顯著；當(dāng)p< 0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1PCR法對(duì)引物特異性的驗(yàn)證結(jié)果

選取干酪發(fā)酵劑中乳酸乳球菌為非目的模板進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。分別以B.animalissubsp.lactisQYW-BB06DNA、乳酸乳球菌DNA、二者以不同比例混合的DNA為模板，以動(dòng)物雙歧桿菌引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。如圖1所示：泳道1、3、4均在100 bp偏上處有1條清晰條帶，與擴(kuò)增片段大小相符，為116 bp。泳道2為非特異性擴(kuò)增，沒有擴(kuò)增條帶，說明動(dòng)物雙歧桿菌引物不能擴(kuò)增乳酸乳球菌DNA。泳道3、4為目的DNA與非目的DNA以不同比例混合為模板，均只有一條清晰條帶且大小與特異性擴(kuò)增(泳道1)相同。說明引物特異性強(qiáng)，在混合模板條件下未發(fā)生非特異性擴(kuò)增。

M-DNA marker; 1-動(dòng)物雙歧桿菌DNA(目的菌株DNA); 2-乳酸乳球菌DNA(非目的菌株DNA);3-1 ng目的菌株DNA與 1 ng非目的菌株DNA混合;4-1 ng目的菌株DNA 與 50 ng非目的菌株DNA混合;5-水圖1 PCR法對(duì)引物特異性的驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Verification of primer specificity by PCR

2.2熒光定量PCR方法對(duì)引物特異性的驗(yàn)證結(jié)果

采用熒光定量PCR方法對(duì)引物特異性進(jìn)行驗(yàn)證，選取乳酸乳球菌、B.longumsubsp.longumQYW-LB01 DNA為陰性對(duì)照。結(jié)果見表2，動(dòng)物雙歧桿菌引物擴(kuò)增非目的模板得到的Ct值為29.99和無(wú)計(jì)算結(jié)果(noCt)。動(dòng)物雙歧桿菌引物擴(kuò)增目的模板得到的Ct值為14.73。

表2 熒光定量PCR檢測(cè)引物特異性

注：1. 在反應(yīng)體系中，各菌株DNA模板量為50 ng；2. 加粗的Ct值為目的菌株DNA。

在復(fù)雜的微生物體系中，熒光定量PCR擴(kuò)增的目的模板不一定是數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的菌屬，因此有必要在目的DNA和非目的DNA混合體系中驗(yàn)證引物的特異性。在含有大量非目的DNA存在的條件下，動(dòng)物雙歧桿菌引物擴(kuò)增目的DNA時(shí)所得的Ct值差異不明顯(表3)。在目的DNA與乳酸乳球菌DNA混合體系中，所有按不同比例混合的模板所得的Ct值差異不顯著，Ct值的變化(ΔCt)僅從0.01到0.19。在目的DNA與B.longumsubsp.longumQYW-LB01 DNA混合體系中，僅在比例為1∶1 000的體系中ΔCt值較大為1.17，其余按不同比例混合的模板ΔCt值僅從0.02到0.10。說明在含有這2種非目的模板存在的條件下，動(dòng)物雙歧桿菌引物能夠特異性擴(kuò)增目的模板。

表3 熒光定量PCR檢測(cè)引物特異性

注：無(wú)非目的DNA模板混合的陽(yáng)性對(duì)照用加粗的Ct值表示；1.a)1 ng 目的 DNA 與 1 ng 非目的DNA 混合；2.b)1 ng目的DNA 與 50 ng 非目的DNA混合；3.c)1 ng 目的 DNA與150 ng非目的DNA混合；4.d)1 ng目的DNA與 1 000 ng非目的DNA混合。

2.3從干酪樣品中提取DNA

從干酪樣品中提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量直接影響定量的準(zhǔn)確性，所以選擇一種合適的DNA提取方法顯得尤為重要。從干酪樣品中提取DNA的濃度及純度結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，從干酪樣品中提取DNA的純度較高，OD260/OD280值均在1.75～1.82之間。DNA的質(zhì)量濃度變化較大從16.4～24.6 ng/μL不等。干酪貯存第1天時(shí)所提取的DNA量最少，隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，提取DNA的量逐漸增多。

表4 干酪貯存期間提取DNA的純度、濃度檢測(cè)結(jié)果

2.4熒光定量PCR法與平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)干酪中雙歧桿菌

農(nóng)家干酪是一種典型的非成熟、新鮮軟質(zhì)干酪。由于其貨架期短,所以選擇1、5、10、15、20天進(jìn)行雙歧桿菌的檢測(cè)。分別提取1、5、10、15、20天的干酪樣品DNA(表4)，用于熒光定量PCR的檢測(cè)。圖3所示，熒光定量檢測(cè)與傳統(tǒng)平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著(p>0.05)。除干酪貯存的第1天外，熒光定量方法檢測(cè)雙歧桿菌活菌數(shù)均高于平板計(jì)數(shù)方法，這可能與在貯存第1天從干酪中提取DNA數(shù)量較少有關(guān)。在貯存期內(nèi)，干酪樣品中B.animalissubsp.lactisQYW-BB06的活菌數(shù)均大于108CFU/mL。

圖3 熒光定量PCR法與平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)干酪中雙歧桿菌Fig.3 Comparison of Bifidobacterium animalis subsp. lactis count (lg CFU/mL) obtained by real-time PCR and plate count

3 討論

采用平板計(jì)數(shù)法和熒光定量PCR法分別計(jì)數(shù)干酪中B.animalissubsp.lactisQYW-BB06數(shù)量。在干酪的貯存期內(nèi)，采用平板計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)雙歧桿菌的活菌數(shù)時(shí)，活菌數(shù)在8.0～8.3 lg CFU/mL內(nèi)變化。采用熒光定量PCR法計(jì)數(shù)的雙歧桿菌數(shù)時(shí)，在干酪貯存的第1天，菌數(shù)(8.2 lg CFU/mL)量略低于平板計(jì)數(shù)法(8.3 log CFU/mL)，這可能與提取DNA數(shù)量較少有關(guān)；在貯存的第5、10、15、20天，熒光定量PCR計(jì)數(shù)的雙歧桿菌數(shù)量(8.1～8.3 lg CFU/mL)均高于平板計(jì)數(shù)法(8.0～8.2 lg CFU/mL)。這是由于熒光定量PCR法是基于干酪樣品中細(xì)菌DNA濃度和純度進(jìn)行計(jì)數(shù)的，而死菌、處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的DNA均可被提出，無(wú)法區(qū)分活菌及死菌，導(dǎo)致所有狀態(tài)的菌體DNA一同被擴(kuò)增，使結(jié)果偏高[15]。由此，可以看出所得DNA的濃度和純度對(duì)熒光定量PCR計(jì)數(shù)的雙歧桿菌數(shù)量影響較大。大多數(shù)乳制品中的DNA是從其制品內(nèi)所包含的微生物提取得到的，乳制品中DNA的回收率應(yīng)該是恒定的并且盡可能地高。LARPIN研究指出，干酪是一種“濃縮”的乳制品，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，蛋白質(zhì)含量一般在20%～35%，脂肪含量通?！?5%，相當(dāng)于將原料乳中的蛋白質(zhì)和脂肪濃縮10倍，這種復(fù)雜的組成成分會(huì)直接導(dǎo)致DNA的提出率降低[16]。所以干酪在為益生菌提供良好保護(hù)作用的同時(shí)也為提取菌體DNA提高了難度。此外，復(fù)雜的乳制品成分中可能還含有PCR反應(yīng)的抑制因子[17-19]。通常，從乳制品中提取DNA的第一步是將菌體細(xì)胞從乳制品中分離出來(lái)，這不僅簡(jiǎn)化了后續(xù)DNA的提取步驟，還消除了大多數(shù)與乳制品相關(guān)的反應(yīng)抑制劑。目前，已有許多課題組對(duì)此方面進(jìn)行研究，BARUZZI將干酪樣品與檸檬酸鈉溶液混合，用機(jī)械裝置或玻璃珠勻漿使酪蛋白溶解[20]。FLREZ通過多次用緩沖液清洗菌體細(xì)胞，并添加Triton X-100或蛋白酶來(lái)去除酪蛋白[21]。STEVENS在均漿階段加入聚乙二醇，更好地回收菌體[22]。CHRISTINE采用2%檸檬酸三鈉-4%聚乙二醇8000緩沖液將菌體從干酪中分離出來(lái)后提取DNA，得到DNA的濃度較高且純度OD260/OD280值均在1.80～2.11[10]。ABDULAMIR比較了4種從復(fù)雜基質(zhì)中提取DNA的方法，以提取DNA的濃度和純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出采用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取DNA質(zhì)量最高[14]。通過綜合比較分析，選用2%檸檬酸三鈉-4%聚乙二醇8000緩沖液將菌體從干酪樣品種分離出來(lái)，然后利用Wizard試劑盒提取其DNA，獲得DNA純度較高，OD260/OD280值均在1.75～1.82。DNA的質(zhì)量濃度變化從16.4～23.4 ng/μL。

研究發(fā)現(xiàn)，疊氮類染料(疊氮溴化丙錠PMA，疊氮溴化乙錠EMA)可以抑制非活性菌體DNA的PCR擴(kuò)增，這可進(jìn)一步降低熒光定量PCR法計(jì)數(shù)時(shí)出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果[23-24]。éMILIE[13]在使用熒光定量PCR方法檢測(cè)干酪在制作和成熟期間雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和瑞士乳桿菌的活菌數(shù)時(shí)，使用PMA處理從樣品中提取的DNA。結(jié)果表明，PMA可以抑制死菌的DNA擴(kuò)增，這是由于PMA與樣品中死細(xì)胞的DNA分子共價(jià)交聯(lián)，抑制該DNA的PCR擴(kuò)增。但必須指出的是本法雖然可以抑制死菌DNA的擴(kuò)增，但無(wú)法去除全部已滅活的細(xì)胞對(duì)該試驗(yàn)產(chǎn)生的影響，這是由于已經(jīng)滅活的細(xì)菌仍可能具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而疊氮類染料是以細(xì)胞膜完整性作為細(xì)菌活性的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，疊氮類核酸染料檢測(cè)法對(duì)不同細(xì)菌滅活方式的適用性還有待研究。應(yīng)當(dāng)指出，研究使用的兩種計(jì)數(shù)法得出的結(jié)果差異不顯著(p>0.05)。前期研究結(jié)果表明，B.animalissubsp.lactisQYW-BB06具有很強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽性，這為其在干酪中大量存活提供前提條件[25]。在20天的貯存期內(nèi)，雙歧桿菌活菌數(shù)僅微量降低，活菌數(shù)遠(yuǎn)大于死菌數(shù)。這可能是本文未使用疊氮類核酸染料處理提取的DNA，所用兩種計(jì)數(shù)方法得出的結(jié)果仍差異不顯著的原因。

本研究使用的熒光基團(tuán)是非特異性的SYBR Green熒光染料，它具有使用方便不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針、反應(yīng)靈敏價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。但主要的缺點(diǎn)就是容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。因此，為了減少假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，就必須盡可能提高引物特異性。干酪是一種典型的多菌種發(fā)酵的產(chǎn)物，其發(fā)酵劑通常包括2種乳酸乳球菌。所以，在試驗(yàn)中應(yīng)用的引物要求只能擴(kuò)增出目的DNA(B.animalissubsp.lactisQYW-BB06DNA)，而不能擴(kuò)增非目的DNA。SHEU[26]基于tuf基因分別為動(dòng)物雙歧桿菌動(dòng)物亞種、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種、兩歧雙歧、短雙歧、嬰兒雙歧和長(zhǎng)雙歧桿菌設(shè)計(jì)了引物。在熒光定量PCR反應(yīng)中，每一個(gè)目的DNA與其對(duì)應(yīng)的引物都擴(kuò)增出與預(yù)期大小相等的目的片段，且溶解曲線只有單峰。同時(shí)，將每一種引物與其非目的菌株DNA混合均得出陰性結(jié)果。在CHRISTINE[10]的研究中，給出了更加具體的引物特異性驗(yàn)證方法。將各菌株引物分別擴(kuò)增目的菌株DNA(陽(yáng)性對(duì)照)和非目的菌株DNA(陰性對(duì)照)或?qū)⒛康木闐NA與非目的菌株DNA按不同比例混合，觀察Ct值變化。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)，對(duì)目的DNA進(jìn)行擴(kuò)增而非目的DNA不擴(kuò)增。本研究使用的引物參考éMILIE[13]等人的研究，通過普通PCR及熒光定量PCR兩種方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證。結(jié)果表明該引物特異性強(qiáng)，對(duì)干酪發(fā)酵劑中的乳球菌不擴(kuò)增(無(wú)條帶、無(wú)Ct值)；當(dāng)擴(kuò)增與目的菌株同源性較近的長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種DNA時(shí)，所得Ct>29且Tm與目的菌株不同。當(dāng)目的菌株DNA與大量非目的菌株DNA混合時(shí)，不影響目的菌株DNA的擴(kuò)增，所得Ct差異不顯著，這與CHRISTINE[10]的研究結(jié)果相似。

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AssessmentofBifidobacterialviabilityduringcheeseripeningbyreal-timePCRquantification

CHEN Xue1,LIU Han2*,PEI Fang-yi1,LIU Zhen-yan1,HOU Hui-ling1,GUO Hao1, DING Lin1,YANG Wen-qin1,ZANG Chuan-gang1,LIU Yu-chao1,GUAN Hong1*

1(Research Institute of Medicine and Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China) 2(Faculty Office,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China)

To establish a simple, sensitive, accurate and rapid detection method for bifidobacteria in cheese, we compared real-time PCR (qPCR) and plate counts.Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisQYW-BB06 (cfu) enumerated by qPCR were compared to culturableBifidobacteriumanimalissubsp.lactisenumerated by plate counts at 1, 5, 10, 15 and 20 days of cheese manufacture. The specificity of each primer set was assessed by qPCR and PCR, the yield and purity of DNA extracted from cheese were evaluated, and the standard curve was established. Target DNA was successfully amplified to show a single peak on the amplicon melting curve, non-target DNA was not amplified. High DNA yield and quality were obtained from cheese sample with mean OD260/OD280ratios ranging from 1.75 to 1.82. Besides of the first day of cheese storage, qPCR counts were higher than plate counts, values ranged from 0.39 to 2.25%. Real-Time PCR assay can be used in detection of bifidobacteria quantitatively in cheese.

real-time polymerase chain reaction; cheese;Bifidobacterium

碩士，助理研究員(關(guān)宏教授、劉韓工程師為通訊作者，E-mail:1352354944@qq.com，liuhan204@163.com )。

黑龍江省教育廳項(xiàng)目(產(chǎn)B族維生素乳酸菌的篩選及生物特性研究2016-KYYWF-0890)；齊齊哈爾市科技局項(xiàng)目(SFGG-201557)

2017-04-18，改回日期：2017-05-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014556