吳阿寶，黃庭軒,楊祖順，高雯，周幗萍*

1(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢,430023) 2(云南省疾病預防控制中心，云南 昆明，650022)

綠茶飲料污染菌人參土芽孢桿菌的鑒定和分析

吳阿寶1，黃庭軒1,楊祖順2，高雯1，周幗萍1*

1(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢,430023) 2(云南省疾病預防控制中心，云南 昆明，650022)

分析了某批綠茶飲料出現(xiàn)顏色變淺，出現(xiàn)少量片狀沉淀的變質(zhì)原因。首先采用平板計數(shù)瓊脂、橙血清和乳酸菌培養(yǎng)基分離和計數(shù)污染菌，該菌在原料——茶葉和糖中有檢出，原位清洗(Clean In Place，CIP)后能在管道中檢出。16S rRNA序列分析鑒定其主要污染菌最接近脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)和人參土芽孢桿菌(Bacillusginsengihumi)。但是從生理生化特性來看，該污染菌生長pH范圍4.68～7.30，最適pH4.68，生長溫度范圍為15～45 ℃，最適生長溫度為40 ℃，不符合脂環(huán)酸芽孢桿菌屬耐酸耐熱特性。綜合16S rRNA序列分析和生理生化特性，該菌被鑒定為人參土芽孢桿菌。成品中的污染來自原料，因萃茶和灌裝管路的CIP系統(tǒng)未分開，而該菌能耐受原位清洗的酸洗、堿洗和熱水洗，通過灌裝線污染成品。人參土芽孢桿菌首次被發(fā)現(xiàn)是一種低酸性飲料——綠茶飲料的污染菌，該菌對CIP清洗有很好耐受性，導致成品灌裝線的污染。

綠茶飲料；變質(zhì)；人參土芽孢桿菌；脂環(huán)酸芽孢桿菌

綠茶在我國有著悠久的歷史，深受國人喜愛，近20年來在此基礎(chǔ)上研究開發(fā)的綠茶飲料種類繁多。其中茶多酚具有一定抑菌作用[1]，但是pH近中性加上國內(nèi)消費者喜甜，多數(shù)綠茶飲料中加了少量的糖，并且為了保持營養(yǎng)和色澤，殺菌參數(shù)不能過高只需要達到商業(yè)無菌要求即可，所以少量來自原料——茶葉和糖的耐熱芽孢桿菌能存活，并在合適條件下甚至可能導致綠茶飲料變質(zhì)[2]。

2006年首次報道的1株人參土芽孢桿菌(Bacillusginsengihumi)Gsoil 114T是從韓國人參種植園土壤中分離的革蘭氏陽性、需氧或兼性厭氧芽孢桿菌。該菌在營養(yǎng)瓊脂上生長良好，能利用部分碳水化合物作為單一碳源，如D-木糖，但不能利用L型氨基酸和有機酸,氧化酶陽性,觸酶陰性,不能降解生物大分子如淀粉、纖維素、木聚糖、酪蛋白、殼多糖和DNA[3]。之后關(guān)于該菌報道比較少，2013年在陜西省中部2份獼猴桃果園土壤中曾檢出2株人參土芽孢桿菌(認為是嗜酸耐熱菌之一)[4]，直到2013年發(fā)現(xiàn)該菌具有高植酸酶酶活，具有良好的應用前景[5]，2015年對該菌株進行了全基因組測序[6]和異源表達[7～8]。同年在加工后的南美傳統(tǒng)飲料馬黛茶的耐熱菌中也檢出了人參土芽孢桿菌[9]。通過PCR-DGGE方法發(fā)現(xiàn)該菌在脫油麻風樹生物發(fā)酵產(chǎn)氫[10]和硫酸鹽廢水處理加乙酸做碳源時是發(fā)酵菌群中的優(yōu)勢菌[11]。

2015年底某企業(yè)生產(chǎn)的綠茶樣品中出現(xiàn)異常樣品，正常樣品pH值為6.5～6.6，異常品下降到4.8左右，明顯變酸，起初樣品除了顏色變淺外沒有其他變質(zhì)特征，不混濁不產(chǎn)氣，到后期才出現(xiàn)少量片狀沉淀物。本研究分析這起持續(xù)性綠茶飲料污染事件的污染菌是人參土芽孢桿菌，該菌具有耐受工業(yè)CIP(clean in place，原位清洗)的特性，值得業(yè)界關(guān)注。

1 材料與方法

1.1樣品與標準株

正常和變質(zhì)綠茶成品、原料(茶葉、糖和瓶蓋)、各工段包括CIP和SIP(sanitize in place，原位消毒)前后等樣品均由企業(yè)提供。

標準株酸土脂環(huán)芽孢桿菌ATCC49025(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心CICC)。

1.2材料與試劑

平板計數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)、乳酸細菌培養(yǎng)基(man rogosa sharpe medium,MRS)，北京陸橋公司；橙血清瓊脂培養(yǎng)基(orange serum agar,OSA)，英國OXOID公司；麥芽汁瓊脂(malt extract agar,MEA)、BAT瓊脂(BAT Agar)脂環(huán)芽孢桿菌培養(yǎng)基，美國MERCK公司；YSG培養(yǎng)基(yeast starch glucose,YSG)、LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani,LB)及1 mol/L檸檬酸自制。VITEK 2COMPACT鑒定所需試劑和測試卡，法國梅里埃公司；Premix Taq、DL2000 DNA Marker、核酸染料Goldview ，日本TaKaRa公司；瓊脂糖，西班牙Biowest公司；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)引物合成和產(chǎn)物測序，蘇州金唯智科技有限公司。

1.3主要儀器設(shè)備

VITEK 2COMPACT全自動細菌鑒定和藥敏分析儀，法國梅里埃公司；80i正置熒光相差顯微鏡(YS100)，日本Nikon公司；PHS-25酸度計，上海雷磁；FP-1100-C型全自動生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博睿。

1.4實驗方法

1.4.1 微生物的檢測

企業(yè)前期檢測已明確是細菌污染，所以參照《GB 4789.2—2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[12]，樣品振蕩均勻、梯度稀釋，分別在PCA/MRS/OSA/3種平板上澆混或涂布，37 ℃培養(yǎng)2 d后計數(shù)。菌落劃線分純觀察單菌落，革蘭氏染色觀察顯微形態(tài)。

1.4.2 分離株的16S rDNA序列分析

菌裂解液的制備、通用引物(27F和804R或1492R)、加樣體系和PCR程序參見文獻[13-14]，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldenview染色，凝膠成像分析儀觀察PCR擴增結(jié)果，產(chǎn)物送往蘇州金維智公司測序。序列比對：在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行BLASTN比對，采用MEGA(Ver.6.06)軟件構(gòu)建鄰近(neighbor-joining，NJ)法系統(tǒng)進化樹。

1.4.3 VITEK 2COMPACT生化測試和鑒定

挑取OSA培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h的少量菌苔用VITEK 2COMPACT全自動細菌鑒定和藥敏分析儀進行生理生化測試。

1.4.4 生長溫度范圍的檢測

用OSA培養(yǎng)基活化菌株，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基液37 ℃ 140 r/min搖床18 h制備種子液，1%(v/v)接種至LB培養(yǎng)液中于15、20、25、28、37、35、40、45、55、(60±1) ℃水浴培養(yǎng)3 d和空白對照比較觀察細菌生長(主要觀察混濁度)。

1.4.5 pH值生長范圍的檢測

采用1 mol/L檸檬酸調(diào)液體LB培養(yǎng)基的pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)并滅菌，同1.4.4制備種子液接種(1%v/v)靜置培養(yǎng)3 d觀察，初步確定該菌生長pH范圍在pH 4.0～7.0。進而設(shè)置pH的梯度為0.2(即pH 4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0)，每個pH條件下的LB培養(yǎng)液均設(shè)置1個空白，測滅菌后實際pH值(pH 4.02、4.25、4.45、4.68、5.15、5.22、5.50、5.71、5.90、6.05、6.25、6.57、6.98、7.03、7.30、7.42、7.95)，每組3個重復，接種量5%(v/v)；用芬蘭Bioscreen全自動生長曲線分析儀繪制不同pH條件下連續(xù)培養(yǎng)48 h的生長曲線。

1.4.6 耐鹽度測試

制備NaCl含量為0.0%、6.5%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%、16.0%、18.0%、20.0%的pH5.22的LB培養(yǎng)液，滅菌后接種子液(參見1.4.4)1%(v/v)，37 ℃培養(yǎng)48～72 h，對比空白對照觀察生長情況。

2 實驗結(jié)果

2.1分離培養(yǎng)基的比較

采用3種不同分離培養(yǎng)基(OSA/MEA/PCA)對2個綠茶飲料成品樣進行檢測，37 ℃培養(yǎng)24～48 h發(fā)現(xiàn)2份成品的污染菌在3種培養(yǎng)基上菌落形態(tài)單一且相似，可判斷只有一種污染菌。該菌在PCA平板上生長遲緩(需48 h)，數(shù)量少，PCA平板不適合該細菌的分離培養(yǎng)；在MEA和OSA平板上生長快(24 h)數(shù)量多，兩者均適合做分離培養(yǎng)基(見表1)。在MEA平板上為小圓形菌落(4～6 mm)，潤澤，邊緣平整，半透明，顏色與培養(yǎng)基相近，偏黃；在OSA平板上和在MEA平板上的菌落基本一致，在OSA上顏色稍淺。

表1 分離培養(yǎng)基的比較

注:*因菌落蔓延成片為估算值。

2.2分離株顯微形態(tài)觀察

對培養(yǎng)48～72 h的分離株Y3進行革蘭氏染色，革蘭氏陽性菌(G+)芽孢桿菌，大小(0.5～1.0) μm×(1.2～4.5) μm，偏端生芽孢，芽孢與菌體等寬，細胞多數(shù)呈鏈狀(圖1)。

圖1 分離株Y3革蘭氏染色顯微照片F(xiàn)ig.1 The morphology of Y3 under microscopy

2.316SrDNA序列分析結(jié)果

從成品、原料和SIP水中分離了7株菌并進行了16S rDNA序列分析，序列結(jié)果提交GenBank獲得登錄號，詳細信息見表2。

7株菌的鑒定結(jié)果為同一種細菌，最接近的為脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillusspp.)和人參土芽孢桿菌(Bacillusginsengihumi)，這兩個種屬的同源性達到99%～100%，用MEGA6.06構(gòu)建進化樹也顯示7個分離株是同一種細菌(圖2)，與脂環(huán)酸芽孢桿菌屬和人參土芽孢桿菌都非常接近，無法有效區(qū)分，所以只能用生理生化測試來區(qū)分兩者[15]，并且可與其他芽孢桿菌屬有效區(qū)分。

表2 分離株基本信息

顯示分離株最接近脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus spp.)或者是人參土芽孢桿菌(Bacillus ginsengihumi)。自展值為500，表示經(jīng)過500次數(shù)值分析；圖下標尺表示每200個堿基序列中有一個堿基替換。圖2 MEGA 6.06用鄰近法基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences

2.4VITEK2Compact生理生化特性和鑒定結(jié)果

分離株采用全自動微生物鑒定儀VITEK 2Compact的革蘭氏陽性菌鑒定卡(GN test kit) 做生理生化測試，VITEK 2Compact卡片要求37 ℃恒溫好氧培養(yǎng)后鑒定，鑒定結(jié)果為未知菌(Unidentified organism)，其生理生化特性見表3。

表3 VITEK 2 Compact的革蘭氏陽性鑒定卡測試結(jié)果

續(xù)表3

英文縮寫生化試驗結(jié)果英文縮寫生化試驗結(jié)果INO肌醇分解+MdG甲基葡萄糖甙酸化-GlyA氨基乙酸芳胺酶-dMAND-甘露醇+IRHAL-鼠李糖+BGLUβ-葡萄糖苷酶-dTAGD-塔格糖-dTRED-海藻糖-NaCl6.5%6.5%NaCl生長-KAN卡那霉素耐受-

2.5溫度生長范圍

15～60 ℃生長測試發(fā)現(xiàn)溫度為55、60 ℃培養(yǎng)基中無肉眼可見混濁，15、45 ℃培養(yǎng)基中僅有少量混濁，28 ℃開始混濁明顯，37～40 ℃培養(yǎng)基中渾濁度最高；因此初步確定該菌生長溫度范圍在15～45 ℃。37～40 ℃為最適生長溫度。從生長溫度范圍來看該菌是普通中溫菌，不同于脂環(huán)酸芽孢桿菌嗜高溫特性，脂環(huán)酸芽孢桿菌生長溫度范圍為20～70 ℃,最適溫度為40～60 ℃[16]。

2.6pH值生長范圍

選取pH 2.0～9.0之間測試時發(fā)現(xiàn)pH 5.0和pH 6.0時該菌有明顯混濁，pH 4.0和pH 7.0與空白對照比較濁度似有增加，并且在OSA平板上劃線有少量菌落生長，而其余pH值則沒有肉眼可辨的混濁，初步判斷該菌生長范圍在pH 4.0～7.30之間。進一步細化pH值梯度,使用全自動生長曲線分析儀測試，結(jié)果如圖3。

圖3 Y3在不同pH之間的生長曲線Fig.3 The growth curve of Y3 at different pH

從圖3可見當pH 4.02時該菌株連續(xù)培養(yǎng)48 h OD值沒有顯著增長，當pH 7.30時48 h培養(yǎng)OD值略有上升，而pH值為pH 4.68/5.50/6.65時，OD值有顯著上升，其中以pH 4.68時OD值增長最快，峰值最高，可以確認為該菌最適生長pH值。該菌與脂環(huán)酸芽孢桿菌嗜酸性特性(最適pH 3.5～4.5,pH 2.0～6.0之間都能生長)有著顯著不同[16]。

2.7耐鹽度測試結(jié)果

8.0%、10.0%和12.0% NaCl培養(yǎng)液中均有少量菌生長，而14.0%、16.0%、18.0%、20.0% NaCl培養(yǎng)液中沒有肉眼可辨混濁。通過該實驗確認人參土芽孢桿菌耐鹽度可達12%。

2.8鑒定結(jié)果

根據(jù)16S rDNA序列分析該分離株應該是脂環(huán)酸芽孢桿菌屬或者是人參土芽孢桿菌。但是鑒于標準株酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌ATCC49025在PCA/OSA/MEA/LB/MRS培養(yǎng)基上都不生長，而分離株都生長良好；反之ATCC49025在YSG和BAT上生長良好，而分離株卻不能生長，加上文獻報道脂環(huán)酸芽孢桿菌一般培養(yǎng)溫度為45 ℃，最適pH為3.0～3.8，而分離株幾乎不能在這樣的溫度和pH值中生長，所以可以排除該分離株是脂環(huán)酸芽孢桿菌的可能性。鑒于該分離株與文獻描述的人參土芽孢桿菌生理生化特性相似，結(jié)合分子生物學鑒定結(jié)果和生理生化結(jié)果可以判定該分離株為人參土芽孢桿菌。

3 結(jié)果與討論

16S rDNA序列分析目前已成為細菌鑒定到屬的重要方法之一，但是我們卻發(fā)現(xiàn)脂環(huán)酸芽孢桿菌屬和人參土芽孢桿菌的16S rDNA序列一致性達到99%～100%，非常接近并且無法有效區(qū)分，這種情況之前也有報道[15]，生理生化特性[15]、脂肪酶和脂酶的指紋分析都能很好地將這兩者區(qū)分開[17]。有研究者用脂肪酸微生物鑒定系統(tǒng)(MIS) 分析芽胞桿菌屬的90 個種和亞種(其中沒有脂環(huán)酸芽孢桿菌)的脂肪酸成分將其分為5 個脂肪酸群，分別為第 I 群窄溫芽胞桿菌脂肪酸群、第 II 群廣溫芽胞桿菌脂肪酸群、第 III 群嗜堿芽胞桿菌脂肪酸群、第 IV 群嗜酸芽胞桿菌脂肪酸群、第 V 群嗜溫芽胞桿菌脂肪酸群，人參土芽孢桿菌屬于group V中溫菌群[18]。這和我們分離株的生長溫度范圍一致。鑒于分離株為中溫菌生長pH范圍為中性偏酸性(4.68～7.30)特性，該菌被鑒定為人參土芽孢桿菌。

從韓國人參種植園土壤中分離的人參土芽孢桿菌(B.ginsengihumi)在2007年首次被定義為新種，相關(guān)研究很少，從GenBank數(shù)據(jù)庫登記的該菌16S rDNA序列信息來看，該菌曾在法國葡萄藤木質(zhì)化組織[19]、我國陜西獼猴桃果園土壤和浙江鐵皮石斛[20]、吊蘭[21]、太空飛船組件的塵埃顆粒中[22]、灌溉用水[23]、澳大利亞土壤[24]和南非木屑[25]等處分離得到?？梢酝茢嘣摼推渌挎邨U菌一樣主要分布在土壤中進而分布于植物、空氣、水體中，所以我們在茶飲料原料茶葉和糖中也檢出該菌并推測這些植物原料是最初的污染源。芽孢桿菌污染飲料通常是因為殺菌力不足，但是同廠同時期采用相同原料和殺菌參數(shù)的另一條茶飲料冷灌裝線的產(chǎn)品正常說明人參土芽孢桿菌并不能耐受目前的殺菌參數(shù)。反復研究兩條生產(chǎn)線的不同發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)異常的生產(chǎn)線萃茶和灌裝線共用同一CIP系統(tǒng)，部分CIP液回收反復利用，懷疑人參土芽孢桿菌能耐受CIP的酸洗、堿洗和熱水洗從原料到萃茶線再通過CIP系統(tǒng)污染到灌裝線。徹底清洗殺菌后將萃茶和灌裝線CIP系統(tǒng)分開，異常情況就未再次出現(xiàn)。

因為綠茶飲料和OSA培養(yǎng)基的pH值均為6.0，MRS培養(yǎng)基的pH值為6.2，而PCA培養(yǎng)基的pH值為7.0，該菌生長pH范圍較小，在7.0生長微弱，所以在OSA和MRS培養(yǎng)基中生長良好，而在最常用的細菌總數(shù)分離平板PCA上生長較差，細菌總數(shù)僅有前兩者的1/10。

梅里埃的VITEK 2Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)是最成功商業(yè)化細菌鑒定系統(tǒng)，但是該系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫有限，對新種、新屬、變種或較為罕見的細菌分類結(jié)果往往會有偏差。對人參土芽孢桿菌這個相對研究較少的新種VITEK 2Compact則無法鑒定，但可以分析該菌株的生理生化特性。本次分離株雖然不是在含鹽的環(huán)境中分離到的，但是卻具有很高的耐鹽性最高耐鹽度達12%。

人參土芽孢桿菌是第一次作為食品污染菌被報道，該菌具有耐受CIP清洗的能力，一旦污染會導致長期持續(xù)性生產(chǎn)線污染值得業(yè)界關(guān)注。

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IdentificationandanalysisofBacillusginsengihumiinagreen-teabeveragedeterioration

WU A-bao1,HUANG Ting-xuan1,YANG Zu-shun2,GAO Wen1,ZHOU Guo-ping1*

1(School of Biological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Hubei 430023,China) 2(Yunnan Center of Disease Control and Prevention,Kunming 650022,China)

The reason of one batch of green-tea beverage faded with precipitation was studied. Firstly, the contaminated microorganisms of the samples were counted and isolated on PCA, OSA and MRS agars. The isolates were identified to be close to bothAlicyclobacillusspp. andBacillusginsengihumiby 16S rRNA sequence analysis. It could grow from 15 to 45 ℃, while 37-40 ℃ was the best. And it could grow from pH 4.68 to 7.30, while pH 4.68 was the best. Those characters were greatly different from that ofAlicyclobacillus-the thermo-acidophilic bacteria but very similar to that of mesophilic bacteriaB.ginsengihumi. The bacteria were identified asB.ginsengihumi. The materials sugars and tea were suspected to be the pollution resources.B.ginsengihumimight contaminate filling system from extraction system through shared CIP systems while it was resistant to the cleaning of hot acid, water and lye.Bacillusginsengihumiwas firstly found to deteriorate a low acid drink-green tea beverage, with high resistance to CIP.

green-tea beverage;deterioration;Bacillusginsengihumi;Alicyclobacillus

本科(周幗萍教授為通訊作者,E-mail：wjczgp@163.com)。

武漢輕工大學大學生科研項目

2017-04-26,改回日期：2017-05-25

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014634