律文堂 ，尹靜靜 ，劉蓬 ，劉永 ，吳寶杰 ，吳修 ，李效尊

（1．山東省水稻研究所/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心，濟(jì)南，250100；2．山東魚臺(tái)縣農(nóng)業(yè)局；3．山東茌平縣胡屯鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站）

蓮藕品種資源InDel指紋圖譜的構(gòu)建

律文堂1，尹靜靜1，劉蓬1，劉永2，吳寶杰3，吳修1，李效尊1

（1．山東省水稻研究所/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心，濟(jì)南，250100；2．山東魚臺(tái)縣農(nóng)業(yè)局；3．山東茌平縣胡屯鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站）

利用自主開發(fā)的蓮藕高多態(tài)性InDel標(biāo)記，對(duì)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心蓮藕種質(zhì)資源圃中15個(gè)代表性蓮藕品種資源進(jìn)行分子標(biāo)記分析。結(jié)果表明，利用InD38、InD61等7對(duì)引物組合即可區(qū)分該15個(gè)品種資源，并構(gòu)建了各個(gè)品種的InDel指紋圖譜，為蓮藕品種鑒定和育種研究提供了技術(shù)支持。

蓮藕；品種資源；InDel；指紋圖譜

蓮藕（Nelumbo nucifera Geartn.）是我國(guó)栽培面積最大的水生蔬菜。根據(jù)生產(chǎn)用途不同，栽培蓮可分為花蓮、子蓮和藕蓮，藕蓮和子蓮的全國(guó)栽培面積分別為40萬、10萬hm2左右，藕蓮主要集中在湖北、江蘇等長(zhǎng)江中下游地區(qū)，近年來，黃河流域栽培面積發(fā)展較快[1]。山東蓮藕種植歷史悠久，地方名優(yōu)品種眾多，其中以藕蓮為主，省內(nèi)17個(gè)地級(jí)市均有蓮藕分布，全省蓮藕種植面積在5.33萬hm2左右，年產(chǎn)值近30億元，居我國(guó)北方各省之首。蓮藕的表型性狀，尤其是根狀莖性狀受種植方式和環(huán)境的影響較大，僅靠形態(tài)性狀鑒定的傳統(tǒng)手段很難達(dá)到精準(zhǔn)鑒定的要求，相同材料不同記名等問題時(shí)有發(fā)生。

目前DNA分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇等各個(gè)方面。近些年蓮藕SSR和SNP標(biāo)記被相繼開發(fā)，遺傳連鎖圖譜也初步構(gòu)建完成[2～4]，為蓮藕種質(zhì)資源相關(guān)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。采用分子標(biāo)記的方法，繪制蓮藕品種DNA指紋圖譜，已成為蓮藕種質(zhì)資源鑒定的理想解決方案。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的高多態(tài)性InDel（Insertion and Deletion，插入缺失）分子標(biāo)記對(duì)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心蓮藕種質(zhì)資源圃保存的15個(gè)代表性蓮藕品種資源進(jìn)行了指紋圖譜繪制，以便為蓮藕品種資源鑒定保護(hù)和育種實(shí)踐提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心蓮藕種質(zhì)資源圃中15份代表性品種資源，具體如下：鄂蓮4號(hào)、鄂蓮5號(hào)、鄂蓮7號(hào)、齊頭、微山紅蓮、美人紅、大臥龍、大青秸、州城蓮藕、東平蓮藕、桓臺(tái)蓮藕、魚臺(tái)蓮藕、吳家堡蓮藕、太空蓮36號(hào)、芙蓉秋色。該15份材料經(jīng)性狀調(diào)查并結(jié)合RAPD遺傳多樣性分析[5]綜合確定。

1.2 DNA的提取

采用改良CTAB法，主要步驟如下：取200 mg葉片，加入0.8mLDNA提取緩沖液（包括2.5%CTAB，20 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris，1%（m/v） PVP）研磨成勻漿，65℃水浴 30 min；加入等體積氯仿，顛倒混勻，12 000 r/min離心10min；取上清液加入等體積預(yù)冷異丙醇，混勻后置于-20℃沉淀20min；10 000 r/min離心15min，棄上清液，用75%乙醇洗滌沉淀5 min；短暫離心后倒掉上清液，沉淀自然風(fēng)干后加適量TE溶解。

1.3 PCR體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10μL，其中反應(yīng)混合液中包括：5μL的 2×Easy Taq PCR Super Mix for PAGE （北京全式金），DNA （100 ng/μL）模板 0.5 μL，引物 0.5μL（10μmol/L），4μL的ddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共 35個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸5 min。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

PCR產(chǎn)物使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離檢測(cè)，電泳完畢后采用銀染顯影，主要步驟如下：電泳結(jié)束后，輕輕剝下凝膠，用蒸餾水洗兩次；銀染：硝酸銀染色液 （500 mL H2O+1 g AgNO3），輕輕搖動(dòng)，染色 15min，用蒸餾水洗2次；顯色：顯色液（100 mL H2O+1.5 g NaOH+0.5 mL 甲醛），顯色時(shí)需隨時(shí)觀察，待條帶清晰即可；倒掉顯色液，用蒸餾水潤(rùn)洗凝膠，中止顯色反應(yīng)后拍照存檔。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)每個(gè)InDel標(biāo)記檢測(cè)出等位變異的有無，分別以0和1記載各品種的InDel等位變異，在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel標(biāo)記多態(tài)性分析

利用兩個(gè)蓮藕品種（齊頭、太空蓮36號(hào)）基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)和中國(guó)古代蓮參考基因組做序列比對(duì)分析，篩選出三者間均有差異的InDel位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并驗(yàn)證適合PAGE檢測(cè)的引物。在基因組定位的基礎(chǔ)上，篩選出一組在各染色體上均勻分布的46對(duì)標(biāo)記引物 （數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

上述46對(duì)引物對(duì)15個(gè)蓮藕品種資源DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增顯示，46對(duì)引物均能檢測(cè)到多態(tài)性條帶，共檢測(cè)出133個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目不等，變幅為2～5個(gè)，圖1為引物InD78擴(kuò)增結(jié)果。

圖1 InD78擴(kuò)增結(jié)果

表1 InDel標(biāo)記引物名稱及序列

表2 15個(gè)蓮藕品種資源的InDel指紋圖譜

2.2 蓮藕品種資源DNA指紋圖譜的構(gòu)建

對(duì)各品種資源InDel多態(tài)性條帶分析發(fā)現(xiàn)，鄂蓮7號(hào)、微山紅蓮、州城蓮藕、魚臺(tái)蓮藕、吳家堡蓮藕、芙蓉秋色分別在引物 InD108、InD78、InD61、InD84、InD62、InD98檢測(cè)圖譜中有特征譜帶，太空蓮36號(hào)在引物InD84和InD98檢測(cè)圖譜中均有特征譜帶。除上述7個(gè)品種外，其他8個(gè)品種都不具有單一引物擴(kuò)增的特征譜帶，但是僅利用InD38、InD61、InD62、InD78、InD84、InD98、InD108 7 對(duì) 引物組合（表1）即可將15個(gè)品種資源完全區(qū)分開來。利用上述7對(duì)引物擴(kuò)增，構(gòu)建了15個(gè)蓮藕品種的DNA指紋圖譜（表2）。

3 討論與結(jié)論

InDel標(biāo)記在植物基因組中有較高的分布頻率，具有遺傳穩(wěn)定性高、分布廣、多態(tài)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且其分布密度遠(yuǎn)高于SSR，理論上講SSR標(biāo)記包含在InDel標(biāo)記范疇內(nèi)。隨著基因組學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，公共數(shù)據(jù)如EST、cDNA和基因組序列等信息大量出現(xiàn)，使得通過生物信息學(xué)方法得到候選InDel成為可能。該類標(biāo)記一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)在于基于多個(gè)品種DNA序列信息開發(fā)的品種間InDel多態(tài)標(biāo)記成功率高，而且不需要類似SSR標(biāo)記的多態(tài)引物篩選過程，工作效率顯著提升，目前已在水稻、玉米等主要作物中得到廣泛應(yīng)用[6]，但在蓮藕中還沒有相關(guān)報(bào)道。本研究利用己篩選出的46對(duì)InDel引物對(duì)15個(gè)蓮藕品種資源進(jìn)行遺傳分析，所有引物在15個(gè)品種內(nèi)均檢測(cè)到多態(tài)性條帶，只需要7對(duì)引物即可區(qū)分所有檢測(cè)蓮藕品種資源，并基于此構(gòu)建了其DNA指紋圖譜。

通過開發(fā)蓮基因組的有效InDel引物，建立基于InDel分子標(biāo)記分析蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性的技術(shù)平臺(tái)，構(gòu)建蓮藕品種資源的InDel指紋圖譜，可以為蓮藕種質(zhì)資源研究提供分子遺傳學(xué)依據(jù)，指導(dǎo)育種中合理選配親本，減少育種的盲目性，加快遺傳改良進(jìn)程，同時(shí)為品種的鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)等提供技術(shù)支持。

[1]柯衛(wèi)東，黃新芳，李建洪，等.我國(guó)水生蔬菜科研與生產(chǎn)發(fā)展概況[J].長(zhǎng)江蔬菜，2015（14）：33-37.

[2]Yang M,Han Y,VanBuren R,et al.Genetic linkage maps for Asian and American lotus constructed using novel SSR markers derived from the genome of sequenced cultivar[J].BMC Genomics,2012,13(1)：1-11.

[3]Hu J,Gui S,Zhu Z,et al.Genome-wide identification of SSR and SNP markers based on whole-genome resequencing of a Thailand wild sacred lotus(Nelumbo nucifera)[J].PloSOne,2015,10(11)：1-17.

[4]Liu Z,Zhu H,Liu Y,et al.Construction of a high-density,high-quality genetic map of cultivated lotus(Nelumbo nucifera)using next-generation sequencing [J].BMC Genomics,2016,17(1)：466-470.

[5]尹靜靜，李效尊，陰筱，等.山東蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）種質(zhì)資源的RAPD鑒定和遺傳多樣性分析[J].分子植物育種，2015，13（6）：1 323-1 328.

[6]初志戰(zhàn)，郭海濱，曾棟昌，等.秈粳稻基因組295個(gè)InDel標(biāo)記的開發(fā)[J].作物學(xué)報(bào)，2016（6）：932-941.

Construction of M olecular Fingerprint for Lotus Cultivar by InDel Markers

LVWentang1,YIN Jingjing1,LIU Peng1,LIU Yong2,WU Baojie3,WU Xiu1,LI Xiaozun1
(1.Shandong Rice Research Institute/Hydrobiology Research Center,Shandong Academy of Agricultural Sciences,250100;2.Agricultural Bureau of Yutai County in Shandong Province;3.Hutun Town Agricultural Technology Extension Station in Chiping County of Shandong)

Using the self-developed high polymorphism In Delmarkers of lotus root to analyze 15 representative cultivars that came from research center of Shandong Academy of Agricultural Sciences Aquatic Organisms in lotus root germplasm nursery with molecular marker analysis.The results showed that all the 15 lotus cultivas could be identified by 7 pairs of InDel marker primers(InD38,InD61,etc.)and the InDel fingerprint of each cultivar was constructed.This study will provide technical support for identification and breeding of lotus cultivars.

Lotus;Cultivars;InDel;Fingerprint

S645.1

A

1001-3547（2017）18-0094-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.027

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（2014QNM32）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2014GNC110015）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601650）

律文堂，男，博士，助理研究員，主要從事植物遺傳育種工作，E-mail：lvwentang2015@163.com

李效尊，男，通訊作者，博士，副研究員，主要從事水生蔬菜研究，電話：0531-83178067，E-mail：xiaozunli@163.com

2017-07-27