董婷婷，劉嫻，朱延達(dá)，吳偉文，賀振，李良俊

（揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，江蘇，225009）

江蘇蓮藕主產(chǎn)區(qū)黃瓜花葉病毒病發(fā)生分布調(diào)查

董婷婷，劉嫻，朱延達(dá)，吳偉文，賀振，李良俊

（揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，江蘇，225009）

由黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaic virus，CMV）等引起的病毒病害是限制蓮藕產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），調(diào)查了江蘇省蓮藕主產(chǎn)區(qū)CMV的發(fā)生分布狀況。調(diào)查結(jié)果表明，43份蓮藕樣品中共檢測到28份陽性樣品，侵染率達(dá)65.12%，其中揚州寶應(yīng)、邗江及蘇州吳中地區(qū)的檢出率依次為75%、58.6%和100%；表現(xiàn)黃化、花葉及皺縮花葉癥狀的蓮藕葉片中CMV的檢出率達(dá)100%，黃斑、皺縮、斑駁以及無癥蓮藕葉片中也均有檢出，表明CMV在江蘇蓮藕上發(fā)生普遍，且可能產(chǎn)生多種癥狀類型。

蓮藕；黃瓜花葉病毒；酶聯(lián)免疫吸附法；分布

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物，以膨大的根狀莖和蓮籽為主要食用器官，主要分為藕蓮、子蓮和花蓮3種類型[1，2]。蓮藕原產(chǎn)于亞洲南部，主要分布在中國、日本和東南亞地區(qū)，在我國有3 000多a栽培歷史，栽培面積近33.3萬hm2[1]。蓮藕在我國南北各地均有種植，長江流域以南栽培較多，除水田外，還廣泛利用低洼田、池塘和湖蕩種植，是我國重要的水生蔬菜[1]。蓮藕上常見病害有腐敗病、褐斑病、炭疽病和病毒病等20多種類型[3]。目前，有關(guān)蓮藕病毒病的報道較少。1985年，日本山下修一等[4]首次報道了蓮藕條斑病毒（Lotus streak virus）；2011 年，丁自立等[5]發(fā)現(xiàn)在蓮藕生育期中，存在部分植株矮小、葉片包卷不易展開、葉面局部褪色、皺縮等疑似黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaic virus，CMV）侵染的癥狀；2015年，Yu等[6]在表現(xiàn)花葉癥狀的蓮藕上，首次檢測到芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）。

CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員，為單鏈、正義RNA（+ssRNA）病毒，寄主范圍廣泛[7]。 1916年 CMV作為黃瓜花葉病的病原，首次被報道出來，此后，國內(nèi)外大量學(xué)者相繼對其展開研究[8，9]，并報道了該病毒在不同寄主上的為害。CMV可侵染1 000多種單子葉和雙子葉植物，是多種農(nóng)作物和觀賞植物的重要致病病原之一[10]。盡管丁自立等[5]依據(jù)癥狀描述了蓮藕上疑似存在CMV的發(fā)生，但并沒有確切的檢測鑒定結(jié)果，該病毒在蓮藕上的發(fā)生分布狀況、癥狀間的相互關(guān)系亦不清晰。故此，本研究以江蘇省蓮藕主產(chǎn)區(qū)的蓮藕為試驗材料，研究CMV在蓮藕上的發(fā)生分布情況，以期為蓮藕病毒病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015-2016年，在江蘇蓮藕主產(chǎn)區(qū)的揚州寶應(yīng)（蘇北）、邗江（蘇中）及蘇州吳中（蘇南）地區(qū)共采集43份樣品（圖1），其中包括無癥、葉片斑駁、黃化、花葉、黃斑等多種不同癥狀（圖2）。將采集到的樣品置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ELISA檢測

①從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。

③樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

④除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔各加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱中溫育60min。

圖1 江蘇省蓮藕樣品采集地分布

⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（可用洗板機洗板）。

⑥每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

⑦每孔加入終止液50μL，15 min內(nèi)，450 nm波長處測定各孔的OD值。

圖2 蓮藕葉片的不同癥狀

表1 江蘇蓮藕主產(chǎn)區(qū)CMV的ELISA檢測結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 江蘇蓮藕主產(chǎn)區(qū)CMV的發(fā)生分布

在供試的43份蓮藕樣品中，有28份檢測成陽性，檢出率為65.12%（表1），可見CMV在江蘇蓮藕主產(chǎn)區(qū)田間發(fā)生普遍。其中，揚州寶應(yīng)地區(qū)陽性樣品有9份，占寶應(yīng)地區(qū)總樣品的75%；邗江地區(qū)陽性樣品有17份，占邗江地區(qū)總樣品的58.6%；蘇州吳中地區(qū)陽性樣品有2份，占吳中地區(qū)總樣品的100%（圖3）。

圖3 江蘇蓮藕主產(chǎn)區(qū)CMV檢出率

2.2 蓮藕病斑癥狀與CMV侵染的關(guān)系

在江蘇蓮藕產(chǎn)區(qū)采集的43份樣品中，蓮藕葉片分別表現(xiàn)黃斑、皺縮、脈明、黃化、花葉、斑駁等癥狀。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，黃化、花葉、皺縮花葉癥狀樣品的CMV陽性率為100%；黃斑癥狀樣品的CMV陽性率為85.7%；無癥樣品的陽性率為59.3%；皺縮、斑駁癥狀樣品的CMV陽性率為50%；脈明癥狀樣品的CMV檢測結(jié)果均為陰性（圖4）。數(shù)據(jù)表明，CMV侵染蓮藕后，在葉片上可能產(chǎn)生多種癥狀。

圖4 蓮藕不同病癥葉片CMV的檢出率

3 討論與結(jié)論

CMV寄主范圍廣，可侵染1 000多種單子葉和雙子葉植物，能使大部分寄主表現(xiàn)各種典型病毒病害癥狀，例如綠斑型、花葉型、皺縮型及黃化型等[11]。此外，不同作物、同一作物不同的生育期以及不同生長環(huán)境，CMV侵染表現(xiàn)的癥狀有較大的差異[12]。本研究中，ELISA檢測出的陽性樣品中，葉片癥狀各有不同，這個結(jié)果與CMV侵染其他作物時表現(xiàn)一致。當(dāng)然，蓮藕葉片上的病部癥狀是否由該病毒直接或間接導(dǎo)致，尚需要進(jìn)一步研究。本研究共采集了江蘇蓮藕3個主產(chǎn)區(qū)的樣品，揚州寶應(yīng)和邗江的檢出率分別達(dá)到75%和58.6%，蘇州吳中地區(qū)檢出率達(dá)100%，雖然在蘇州吳中地區(qū)的采樣數(shù)偏少，可能導(dǎo)致該地區(qū)的CMV檢出率值偏高，但仍然能反映CMV在江蘇省蓮藕主產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生。

CMV在自然界主要通過寄主植物種子、繁殖材料及昆蟲傳播。而蓮藕主要以根狀莖進(jìn)行無性繁殖，CMV的侵染和逐年積累可能加劇蓮藕種性退化，引起蓮藕產(chǎn)量和品質(zhì)降低。本研究中單純采用ELISA法檢測，樣品集中在江蘇省蓮藕主產(chǎn)區(qū)的部分采樣點，可能存在一定的局限性，后續(xù)試驗中需要擴展樣品采集地點，加大采樣量，并通過ELISA和RT-PCR相結(jié)合的方法，來確定CMV在我國蓮藕上的發(fā)生分布情況，為進(jìn)一步開展蓮藕上CMV的發(fā)生流行、致病機制及科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

[1]劉義滿，柯衛(wèi)東.關(guān)于提高蓮產(chǎn)業(yè)效益的建議[J].長江蔬菜，2012（16）：134-137.

[2]李效尊，尹靜靜，杜紹印，等.水生蔬菜營養(yǎng)及藥用價值研究進(jìn)展[J].長江蔬菜，2015（22）：25-30.

[3]劉義滿，吳仁鋒，楊紹麗.24種蓮病害名錄[J].長江蔬菜，2015（22）：213-217.

[4]山下修一，土居養(yǎng)二，與良清，等.ハスで見出されたラブドウイルス；ハス條斑ウイルス（lotus streak virus，LSV)について[J].日本植物病理學(xué)會報，1985（51）：627-631.

[5]丁自立，吳金平，刁英，等.蓮藕主要病害及其綜合防治[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（15）：3 078-3 079.

[6]Yu X,Sheng JJ,Zheng XW,et al.First report of Dasheen mosaic virus infecting lotus(Nelumbo nucifera)in China[J].Plant Disease,2015,99(10)：1 449.

[7]張華榮.侵染半夏的黃瓜花葉病毒研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2006.

[8]Doolittle SP.A new infectious mosaic disease of cucumber[J].Phytopathology,1916,6(2)：142-144.

[9]Jagger IC.Experiments with the cucumber mosaic disease[J].Phytopathology,1916,6(2)：149-151.

[10]Edwardson JR,Christie R G.CRC handbook of viruses infecting legumes[M].CRCPress,1991：293-319.

[11]王達(dá)新，郭剛，殷曉敏，等.黃瓜花葉病毒研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（3）：121-123.

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Investigation on Occurrence and Distribution of Cucumber Mosaic Virus in Main Producing Areas of Lotus Root in Jiangsu

DONG Tingting,LIU Xian,ZHU Yanda,WUWeiwen,HE Zhen,LILiangjun
(School of Horticulture and Plant Protection,Yangzhou University,225009)

Virus disease caused by cucumber mosaic virus (CMV)is one of the important factors limit the yield and quality of lotus root.In this study,The occurrence and distribution of CMV in the main producing areas of lotus root in Jiangsu province was investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The results showed that 28 positive samples were detected in 43 lotus samples,and the infection rate was 65.12%,while the infection rates of Baoying and Hanjiang in Yangzhou and Wuzhong region in Suzhou were 75%,58.6%and 100%,respectively.The detection rate of CMV in lotus leaves of yellow,mosaic and shredded mosaic was 100%,which was also detected in the leaves of chlorotic,symptom less,shrinking and mild mottle.All these indicated that CMV was common in lotus root of Jiangsu Province,and was likely to produce various types of symptom.

Lotus root;Cucumbermosaic virus;Enzyme-linked immunosorbent assay;Distribution

S645.1；S463.45

A

1001-3547（2017）18-0144-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.045

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[CX（16）1011]董婷婷（1997-），女，在校本科生，園藝專業(yè)，E-mail：912768255@qq.com

李良?。?969-），男，通訊作者，教授，博導(dǎo)，長期從事水生蔬菜栽培研究，E-mail：ljli@yzu.edu.cn

2017-08-16