魏林，梁志懷，成燕清

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙，410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心）

子蓮品種抗鐮刀菌腐敗病的室內(nèi)鑒定方法

魏林1，梁志懷2，成燕清1

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙，410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心）

應(yīng)用蓮籽萌發(fā)的實(shí)生苗浸根接種鐮刀菌腐敗病病原，根據(jù)接種實(shí)生苗葉片表現(xiàn)出的腐敗病癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)病害等級(jí)進(jìn)行鑒定，進(jìn)而確定子蓮品種對(duì)腐敗病菌的抗病能力。該方法實(shí)現(xiàn)了室內(nèi)快速、準(zhǔn)確鑒定不同子蓮品種對(duì)鐮刀菌腐敗病的抗性。

蓮籽；鐮刀菌腐敗?。豢焖勹b定；抗性

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

①供試病原菌 從腐敗病病組織分離經(jīng)過(guò)單胞分離純化后，再通過(guò)形態(tài)學(xué)、柯赫氏法則驗(yàn)證、分子鑒定確定的蓮真菌性腐敗病病原菌——尖孢鐮刀菌蓮?；汀?/p>

②供試子蓮 選擇顆粒飽滿、充分成熟的當(dāng)年蓮籽作為供試材料。

③感病對(duì)照和抗病對(duì)照的選擇 選擇當(dāng)?shù)刂髟缘?、歷年腐敗病發(fā)生較為嚴(yán)重的品種，作為感病對(duì)照；選擇當(dāng)?shù)刂髟缘?、歷年腐敗病發(fā)生較輕的品種，作為抗病對(duì)照。

1.2 試驗(yàn)方法

①子蓮腐敗病病原菌強(qiáng)致病性菌株的篩選供試腐敗病鐮刀菌病原菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，用無(wú)菌打孔器自菌落邊緣取7 mm的菌餅，縱剖切取大小一致的新鮮藕塊，將菌餅置于藕塊的中央位置，菌絲體面朝下，每個(gè)藕塊等距離接種2個(gè)鐮刀菌菌餅，然后將裝有已接種藕塊的發(fā)芽盒置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5～7 d。按下述分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查藕塊發(fā)病情況：0級(jí)，藕塊生長(zhǎng)正常、完好；1級(jí)，藕塊表面有輕微病變，病變尚未侵及藕塊體內(nèi)組織；2級(jí)，藕塊組織有明顯病變，維管束呈褐色；3級(jí)，藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的 10%以下；4級(jí)，藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的 10%～30%；5級(jí)，藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的30%以上。每個(gè)藕塊為一計(jì)量單位，每種病原菌接種20個(gè)藕塊。病情指數(shù)=∑（各級(jí)藕塊數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/(調(diào)查總藕塊數(shù)×5）×100；其致病力強(qiáng)弱的劃分標(biāo)準(zhǔn)：病情指數(shù)>70，表示強(qiáng)致病力；30<病情指數(shù)≤70，表示中致病力；病情指數(shù)≤30，表示弱致病力；病情指數(shù)為0，表示無(wú)致病力。選取強(qiáng)致病性菌株作為子蓮品種抗病鑒定的接種菌株。

②接種體的繁育 將保存于PDA斜面培養(yǎng)基中的腐敗病菌株移植于PDA平板培養(yǎng)基上，在25℃條件下培養(yǎng)，待菌株菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，在無(wú)菌條件下，接種于盛有PD培養(yǎng)液的三角瓶中（液體培養(yǎng)基的量以占三角瓶容量的30%～35%為宜），25℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)液經(jīng)2層滅菌紗布過(guò)濾，再經(jīng)4 000 r/min離心10 min，倒掉上清液后，加入滅菌蒸餾水調(diào)制成分生孢子濃度為1×105個(gè)/mL的接種體懸浮液。

③鑒定材料的培育 將當(dāng)年生的蓮籽，用尖嘴鋼鉗把含蓮籽種臍一端破一小口后，完全浸沒(méi)于無(wú)菌水中。待種子發(fā)芽后，將發(fā)芽蓮籽移植適宜水培的容器，倒入剛好浸沒(méi)蓮籽的適量滅菌水，于25℃條件下培育。

④鑒定材料的接種及接種后的管理 當(dāng)發(fā)芽的蓮籽長(zhǎng)至具3～5條根的實(shí)生苗（此時(shí)一般有3～5片葉）時(shí)，用滅菌的剪刀將每條根在距根尖0.5 cm處剪斷，以造成根系的微傷口，然后將整個(gè)根系浸入由無(wú)菌水調(diào)節(jié)的含1×105個(gè)孢子/mL接種體懸浮液中30 min，以浸泡等體積無(wú)菌水的實(shí)生苗為對(duì)照。將接種后的實(shí)生苗移栽至盆缽中栽培，栽培土為滅菌的砂壤土。每個(gè)材料重復(fù)3次，每重復(fù)20株苗。接種室的溫度保持在24～26℃，栽種缽內(nèi)始終保持有1～2 cm的水層。

1.3 鑒定材料病情調(diào)查

表1 子蓮抗腐敗病室內(nèi)鑒定病情級(jí)別的劃分

表2 子蓮品種對(duì)腐敗病抗性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

②調(diào)查時(shí)間 接種后15～20 d調(diào)查，并根據(jù)此期間感病的對(duì)照品種病級(jí)擴(kuò)展到感病病級(jí)的時(shí)間作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

③調(diào)查方法和病情指數(shù)的計(jì)算 調(diào)查每一株苗所有展開(kāi)的葉片，根據(jù)表1中癥狀描述調(diào)查、記載每份材料葉片的病情級(jí)別，并按式①計(jì)算病情指數(shù)DI。

DI=[∑（di×li）]/（L×6）×100 式①

式①中，di表示各病情級(jí)別的代表數(shù)值；li表示各病情級(jí)別對(duì)應(yīng)的葉片數(shù)；L表示調(diào)查總?cè)~片數(shù)。

表3 不同子蓮品種不同接種時(shí)期發(fā)病情況

1.4 鑒定材料抗病性評(píng)價(jià)

①抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)被鑒定材料3次重復(fù)的病情指數(shù)（DI）平均值，按表2劃分標(biāo)準(zhǔn)確定其抗性水平。

②鑒定有效性判別 當(dāng)感病對(duì)照材料達(dá)到相應(yīng)感病程度（DI＞60），抗病對(duì)照材料與實(shí)際抗性程度相符時(shí)，該批次鑒定視為有效。

2 實(shí)施實(shí)例

在湖南省湘潭地區(qū)白石鎮(zhèn)、石鼓鎮(zhèn)、烏石鎮(zhèn)子蓮主種植區(qū)，選取對(duì)蓮腐敗病表現(xiàn)不同抗性的本地子蓮品種，無(wú)具體名稱，本研究將其分別命名為湘蓮1，2，3，4號(hào)。其中湘蓮1號(hào)在主栽地表現(xiàn)為感病品種，田間最高發(fā)病率可達(dá)75%以上；湘蓮2號(hào)和3號(hào)在主栽地表現(xiàn)為中抗品種，田間發(fā)病率一般為25%～40%；湘蓮4號(hào)在主栽地表現(xiàn)為高抗品種，田間最高發(fā)病率一般為5%～8%。按本文所述方法對(duì)上述4個(gè)品種進(jìn)行了腐敗病抗性的室內(nèi)鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 小結(jié)

應(yīng)用本方法多次試驗(yàn)結(jié)果表明，接種10 d，田間抗性表現(xiàn)不同的品種，在盆栽試驗(yàn)發(fā)病率上已顯示出抗性的區(qū)別，但病情指數(shù)尚未有顯著的差異；隨著病情發(fā)展，接種20 d時(shí)，不同抗性品種間的發(fā)病率和病情指數(shù)呈現(xiàn)顯著差異，但接種20～25 d時(shí)，不同抗性品種間的發(fā)病率差異又逐漸趨于不顯著，而通過(guò)病情指數(shù)所確定的各品種的抗性能力已很穩(wěn)定，20 d、25 d與30 d抗性評(píng)價(jià)結(jié)果均完全一致，說(shuō)明應(yīng)用病情指數(shù)鑒定品種對(duì)腐敗病的抗病性較應(yīng)用發(fā)病率鑒定更為準(zhǔn)確和科學(xué)，在接種后20～25 d通過(guò)比較病情指數(shù)，能完全區(qū)分出子蓮不同品種間對(duì)腐敗病抗性的差異。多次不同品種鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)腐敗病室內(nèi)抗性鑒定結(jié)果與田間抗病表現(xiàn)完全吻合，證明應(yīng)用該鑒定方法能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定出不同子蓮品種對(duì)鐮刀菌腐敗病的抗性能力，可為大量篩選子蓮腐敗病抗病品種提供一個(gè)可靠依據(jù)。

Laboratory Method on Identifying Resistance to Fusarium Rot for Seed Lotus Cultivars

WEILin1,LIANG Zhihuai2,CHENG Yanqing1
(1.Institute of Plant Protection,Hunan Academy ofAgricultural Sciences,Changsha 410125;2.Hunan Agricultural Biotechnology Research Center)

The roots of germination seedlings from lotus seeds were dipped to inoculate pathogens of Fusarium rot.According to the classification standard of rot symptoms to the seedling blade,the levels of disease were identified.And then,the resistance of seed lotus cultivars to Fusarium rotwas determined.The method realizes the resistance evaluation of seed lotus root cultivars to Fusarium rot rapidly and exactly in laboratory.

Lotus seed;Fusarium rot;Rapid identification;Resistance

S645.1；S436.45

A

1001-3547（2017）18-0154-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.048

子蓮屬睡蓮科植物，是中國(guó)蓮三大品系（藕蓮、子蓮、花蓮）栽培品種之一，因其具有觀賞價(jià)值高的蓮花、味美可口的鮮食嫩籽、可加工成各種營(yíng)養(yǎng)豐富食品的老熟蓮籽，在我國(guó)具有十分悠久的種植歷史。近年來(lái)，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，我國(guó)的子蓮種植面積有了較大幅度增加，已成為蓮農(nóng)創(chuàng)收的重要途徑。

子蓮從浮葉生出到蓮蓬采收的整個(gè)生育期，都會(huì)受到腐敗病的為害，該病可使子蓮地下莖腐爛壞死，地上部枯萎，一般造成子蓮減產(chǎn)20%～45%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)60%以上，甚至絕收，嚴(yán)重影響了蓮籽的品質(zhì)和產(chǎn)量。蓮腐敗病主要是由鐮刀菌屬真菌侵染引起的一種土傳病害，該病首先為害子蓮的地下莖（藕節(jié)），地下部受到病原菌的侵染出現(xiàn)病變后，病莖生出的地上部葉片和葉柄才逐漸顯癥。由于蓮鐮刀菌腐敗病發(fā)生時(shí)種植環(huán)境的特殊性、地上部顯癥明顯的滯后性以及荷葉特殊的納米結(jié)構(gòu)使得藥液難附著性，都增加了該病的防治難度，使得常規(guī)的防治措施很難取得較好的防控效果。因此，選育和種植抗病品種是防治該病經(jīng)濟(jì)有效的方法之一，其中建立便利高效的子蓮抗腐敗病的鑒定評(píng)價(jià)體系和方法，是開(kāi)展該項(xiàng)工作的基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用蓮籽實(shí)生苗，通過(guò)人工接種腐敗病菌，并根據(jù)實(shí)生苗葉片發(fā)病特點(diǎn)制定了相應(yīng)的發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及品種抗性等級(jí)，獲得了一套子蓮抗腐敗病室內(nèi)鑒定技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了不同子蓮品種對(duì)鐮刀菌腐敗病抗性的室內(nèi)快速、準(zhǔn)確鑒定?，F(xiàn)將該方法介紹如下。

湖南省蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目；湖南省技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（2016NK3015）

魏林（1970-），女，博士，研究員，主要從事水生蔬菜病害綜合防治研究，電話：0731-84693299，E-mail：nkyweilin@163.com

2017-07-10